曹偉佳，茍冬梅，梁麗亞，劉嶸明，陳可泉，馬江鋒,2，姜岷

1 南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程與國家重點實驗室，江蘇 南京 211816

2 中國石化揚子石油化工有限公司南京研究院，江蘇 南京 210048

大腸桿菌 NZN111由于缺乏了乳酸脫氫酶的編碼基因 (ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的編碼基因 (pflB)而使副產物乳酸和甲酸的生產途徑阻斷，具有潛在生產丁二酸的能力。但同時由于NADH依賴的乳酸脫氫酶 (LDH)無法合成而限制了糖酵解過程中 NADH再生為 NAD+的過程，造成輔酶不平衡，導致該菌株厭氧條件下不能利用葡萄糖進行生長[1-3]。煙酸轉磷酸核糖激酶(NAPRTase)是NAD(H)合成系統(tǒng)中的限速酶[4-6]。Liang等[7]通過在 NZN111中過量表達 NAPRTase基因 pncB，NAD+的濃度提高了 6.2倍，NADH/NAD+的比例大大降低，從而細胞生長和丁二酸產量有了大幅度提高。然而，發(fā)酵過程中伴隨著大量的副產物丙酮酸生成，這是因為葡萄糖磷酸轉移酶系統(tǒng) (簡稱PTS)攝入胞外葡萄糖時，需要消耗磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)生成副產物丙酮酸，直接影響了丁二酸生產得率[8-9]。丙酮酸羧化酶(PYC)可催化丙酮酸到丁二酸前體草酰乙酸的反應，在重組大腸桿菌中表達有利于減少丙酮酸生成，提高丁二酸產量[10-12]。

本研究通過在E. coli BA002 (E. coli K12 △ldhA、△pflB)共表達煙酸轉磷酸核糖激酶和外源丙酮酸羧化酶，構建了重組菌 BA016(BA002/pTrc99a-pncB-pyc)，增加NAD(H)的總量，降低NADH/NAD+比例，同時減少了副產物丙酮酸的積累并促進了丁二酸的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

BA002、BA014、BA015 (BA002/pTrc99a-pyc)和BA016，由南京工業(yè)大學生物過程與系統(tǒng)工程實驗室自主構建；質粒pTrc99a，由南京師范大學邵蔚藍教授惠贈。所有菌株用 20%甘油保藏在–80 ℃。發(fā)酵培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0，氨芐青霉素的終濃度為100 μg/mL。血清瓶發(fā)酵為添加 20 g/L葡萄糖和16 g/L堿式碳酸鎂；發(fā)酵罐發(fā)酵為添加35 g/L葡萄糖和 28 g/L 堿式碳酸鎂。加入終濃度分別為0.5 mmol/L煙酸和0.3 mmol/L誘導劑IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以誘導表達NAPRTase和PYC。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將保存于–80 ℃的菌種在加有氨青霉素的平板上活化，挑單菌落于5 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：接1 mL種子培養(yǎng)液加入到150 mL LB，有氧培養(yǎng)6 h。將種子液以15%的接種量接入裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，溫度和攪拌速率分別維持在30 ℃和170 r/min。以0.2 L/min的速率持續(xù)通入CO2。

1.2.2 分析方法

細胞生長用紫外可見分光光度計于波長 600 nm處測定吸光度值，有機酸、葡萄糖用高效液相色譜法 (HPLC)檢測。

測定蛋白濃度用 Bradford法[13]，以牛血清白蛋白 (BSA)為標準。NAPRTase酶活測定參照文獻[14]。PYC酶活測定參照文獻[15]。輔酶NADH與NAD+的濃度根據酶循環(huán)機理[16]測定。

2 結果與分析

2.1 對照菌與重組菌在血清瓶中純厭氧發(fā)酵

由表1可知：72 h純厭氧發(fā)酵后，BA002細胞干重僅為 0.52 g/L，合成了 1.57 g/L丁二酸，1.90 g/L丙酮酸。重組菌株BA014恢復了生長能力和發(fā)酵產酸能力，細胞干重是對照菌的 3.33倍，合成丁二酸5.04 g/L，但積累了4.71 g/L的丙酮酸。而BA015細胞干重為0.93 g/L，雖然丙酮酸減少至0.29 g/L，但合成的丁二酸只有3.61 g/L。重組菌BA016合成 15.68 g/L的丁二酸，比對照菌增加了7.97倍，而丙酮酸只有0.15 g/L。表2可知72 h厭氧條件下誘導后，BA016中 PYC的酶活增加至1.87 U/mg。BA014和BA016中NAPRTase的酶活明顯高于BA002中的NAPRTase酶活。表2可以看出，重組菌株 BA016中 NADH/NAD+的比例從BA002中的0.60下降至BA014中的0.16和BA016中的0.05，該比例不斷趨于輔酶平衡。

表1 不同菌株在LB培養(yǎng)基中72 h純厭氧發(fā)酵結果Table 1 Results of exclusively anaerobic fermentations of the strains after 72 h in LB media

表2 不同菌株發(fā)酵72 h后PYC酶活、NAPRTase酶活和NAD(H)的測定Table 2 Enzyme assays and determination of the amount of NAD(H)in anaerobic fermentations of the strains after 72 h

2.2 BA016在3 L發(fā)酵罐中的純厭氧發(fā)酵

由圖1可以看出，發(fā)酵112 h后，共消耗了35 g/L的葡萄糖，菌體 OD600為 4.64，產生了 25.09 g/L丁二酸。41 h時，丙酮酸的濃度積累到3.23 g/L，隨后開始下降，52 h時為0.09 g/L，而乙酸增加至2.35 g/L。表3可以看出41 h相比于0 h的PYC酶活顯著增加至0.88 U/mg，此時代謝流從丙酮酸轉向丁二酸的前體物草酰乙酸，這很可能是丙酮酸下降的原因。此外，41 h到64 h，NADH/NAD+下降了 4倍，丁二酸的生產效率達到最高，為0.4 g/(L·h)。說明下降的 NADH/NAD+對菌株生長和合成丁二酸具有促進作用。64 h后雖然葡萄糖消耗速率仍然很高，但是丁二酸生產效率下降，此時碳通量流向部分副產物的支路。酶活PYC的下降導致丙酮酸的積累，菌株在后期厭氧發(fā)酵時，NADH的不足導致蘋果酸及富馬酸的積累。

圖1 BA016在 3 L發(fā)酵罐中厭氧發(fā)酵的細胞生長(OD600)、葡萄糖消耗及有機酸的生成Fig. 1 Anaerobic fermentation in 3 L fermentor by BA016.OD600 (open circle), glucose (filled square), succinic acid(open diamond), acetic acid (filled diamond), pyruvic acid(filled triangle), malic acid (open square).

表3 3 L發(fā)酵罐中不同時間段PYC的酶活和NADH/NAD+的比例Table 3 Determination of specific enzyme activity of PYC and NAD(H)at different time in 3 L fermentor

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