吳明科，劉嶸明，梁麗亞，馬江鋒,2，陳可泉，姜岷

1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816

2 中國石化揚子石油化工有限公司研究院，江蘇 南京 210048

丁二酸，又被稱為琥珀酸，是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物同時也是厭氧發(fā)酵中碳代謝的終端還原性產(chǎn)物之一，作為一種重要的化工原料和中間體，廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)[1]。相對于化學(xué)合成法，生物法[2-5]合成丁二酸由于消耗低、污染小、反應(yīng)溫度等優(yōu)點，已成為近年來研究的熱點[6-7]。

大腸桿菌 AFP111是有氧-厭氧兩階段生產(chǎn)丁二酸的潛力菌株[8]。Vemuri等[9]研究了有氧轉(zhuǎn)厭氧時間節(jié)點對菌體產(chǎn)丁二酸的影響，姜岷等[10]通過有氧階段碳限制策略提高細胞活力，使AFP111產(chǎn)丁二酸量達到101.2 g/L。但是，隨著厭氧發(fā)酵時間的延長，菌體的活力不斷降低[11]，菌體的產(chǎn)酸速率也不斷下降。Andersson等[12]在發(fā)酵過程中通過去除產(chǎn)物丁二酸來保持菌體的高產(chǎn)酸能力，結(jié)果表明整個 100 h的厭氧發(fā)酵過程中丁二酸產(chǎn)量提高達60%以上。然而丁二酸生產(chǎn)效率明顯降低。文中通過有氧誘導(dǎo)回收的菌體細胞，提高菌體轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)酸能力，進一步提高轉(zhuǎn)化過程中丁二酸的產(chǎn)量及生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌 Escherichia coli AFP111 [F+λ-rpoS396 (Am)rph-1 △(pflAB::Cam)ldhA::Kan 95ptsG]由 David P.Clark 教授 (Southern Illinois University)惠贈。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)基

有氧搖瓶培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，氯霉素添加量為25 μg/mL，硫酸卡那霉素添加量 30 μg/mL。

JSM培養(yǎng)基參考文獻[13]。

血清瓶培養(yǎng)基：JSM培養(yǎng)基如前所述。JSM-P培養(yǎng)基為在JSM培養(yǎng)基中去除磷酸鹽，JSM-N培養(yǎng)基為JSM培養(yǎng)基中去除銨鹽，JSM-T培養(yǎng)基為在JSM培養(yǎng)基中去除微量元素，JSM-B培養(yǎng)基為在JSM培養(yǎng)基中去除生物素和VB1，BM培養(yǎng)基為只含無菌水培養(yǎng)基。

1.2.2 種子培養(yǎng)

將保存于–80 ℃凍存管中的菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為 5 mL的試管中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后，以1%的接種量接種到裝液量為100 mL的500 mL搖瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h。

1.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)

將種子液以10%的接種量接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的 7.5 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter;New Brunswick ScientificCo., Edison, N.J.)，初糖濃度為30 g/L，12.5%的氨水調(diào)節(jié)pH 6.8, 37 ℃有氧培養(yǎng)至初糖耗盡，流加800 g/L葡萄糖，控制菌體的相對生長速率為0.7 h–1至OD600=60；厭氧階段，無菌過濾條件下通二氧化碳氣體，通氣量0.5 L/min，25%的 Na2CO3調(diào)節(jié) pH 6.6，厭氧發(fā)酵 60 h。

1.2.4 細胞離心回收與轉(zhuǎn)化發(fā)酵

兩階段發(fā)酵結(jié)束，收集發(fā)酵液，離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)獲得細胞，用雙蒸水懸浮后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐進行轉(zhuǎn)化實驗。有氧誘導(dǎo)3 h后，厭氧發(fā)酵條件同上。

1.3 分析

細胞生物量OD600，菌體干重，葡萄糖濃度，有機酸濃度參考文獻[14]，酶活參考文獻[15]。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的優(yōu)化

有氧-厭氧兩階段生產(chǎn)丁二酸時，有氧階段使用JSM培養(yǎng)基主要提供菌體生長所需營養(yǎng)元素，用于菌體細胞生長，而在厭氧轉(zhuǎn)化過程中，菌體主要利用葡萄糖進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，菌體密度不會增長[9]，JSM 培養(yǎng)基中成分更多起到緩沖鹽作用。因此，優(yōu)化轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分對菌體產(chǎn)酸以及發(fā)酵成本降低是十分重要的。

由表1可知，發(fā)酵整個過程BM培養(yǎng)基中菌體DCW降低最大，達到1.6 g/L，其余培養(yǎng)基中菌體DCW變化較小。各個組分的培養(yǎng)基中菌株耗糖，副產(chǎn)物乙酸量相差不大。當 BM 培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基時，丁二酸得率最高，達到 93%，且單位細胞生產(chǎn)率相比于JSM培養(yǎng)基只降低了0.9%，所以采用BM培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)基。

2.2 有氧誘導(dǎo)時間對菌體轉(zhuǎn)化的影響

隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，菌體的產(chǎn)酸速率逐漸降低，而通過空氣進行有氧誘導(dǎo)可以部分恢復(fù)菌體中一些關(guān)鍵酶如異檸檬酸裂解酶[15-16]等活力，以利于菌體進行下一次轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)酸。故進行了0 h、1 h、3 h和5 h 四個不同有氧誘導(dǎo)時間梯度對菌體產(chǎn)酸的考察。由圖1表明，在0～3 h范圍內(nèi)，菌體凈產(chǎn)酸量 (去除厭氧開始時殘留的丁二酸量)和總產(chǎn)酸量隨著有氧誘導(dǎo)時間的增長而增加，而繼續(xù)提高有氧誘導(dǎo)時間至 5 h并沒有繼續(xù)增加菌體產(chǎn)酸的能力，故選擇3 h為最佳有氧誘導(dǎo)時間。

由表2可知，3 h誘導(dǎo)后磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)，蘋果酸脫氫酶 (MDH)酶活相較于無誘導(dǎo)條件下分別提高了 31%和 46%，有利于還原性TCA循環(huán)支路產(chǎn)丁二酸，而異檸檬酸裂解酶 (ICL)酶活增加了7倍，表明乙醛酸途徑得到了加強，從而有利于丁二酸的生成，使丁二酸的產(chǎn)量提高。

表1 厭氧血清瓶發(fā)酵后參數(shù)的測定結(jié)果Table 1 Results of these parameters on anaerobic fermentation in sealed bottles

圖1 不同有氧誘導(dǎo)時間對菌體產(chǎn)酸的影響Fig. 1 Effect of different aerobic time on the final succinic acid concentration. Net succinic acid equals final succinic acid concentration minus initial succinic acid concentration;total succinic acid equals final concentration.

2.3 連續(xù)轉(zhuǎn)化發(fā)酵

發(fā)酵罐厭氧發(fā)酵 60 h，丁二酸產(chǎn)量達到68.01 g/L，單位生產(chǎn)率為112.88 mg/(g·h)。此時通過離心收集菌泥，用無菌水洗滌稀釋OD600至60進行有氧誘導(dǎo)，結(jié)束后開始重新發(fā)酵。由表3可知，重新發(fā)酵后丁二酸產(chǎn)量分別為55.9 g/L和45.6 g/L，單位菌體的生產(chǎn)速率分別為92.84 mg/(g·h)和 76.30 mg/(g·h)。整個過程 (菌體有氧生長時間計算在內(nèi))產(chǎn)酸速度達到0.81 g/(L·h)，相比于無有氧誘導(dǎo)條件下發(fā)酵時的產(chǎn)酸速度0.72 g/(L·h)提高了13%，總產(chǎn)量提高了19 g/L。

表2 厭氧發(fā)酵開始時酶活的測定Table 2 Enzyme activities of cells at the beginning of anaerobic succinate production

表3 發(fā)酵結(jié)果各參數(shù)的測定Table 3 Result of parameters on anaerobic fermentation

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