亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        大腸桿菌AFP111菌體回收連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丁二酸

        2013-10-31 10:31:22吳明科劉嶸明梁麗亞馬江鋒陳可泉姜岷
        生物工程學(xué)報 2013年12期
        關(guān)鍵詞:丁二酸產(chǎn)酸發(fā)酵罐

        吳明科,劉嶸明,梁麗亞,馬江鋒,2,陳可泉,姜岷

        1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室,江蘇 南京 211816

        2 中國石化揚子石油化工有限公司研究院,江蘇 南京 210048

        丁二酸,又被稱為琥珀酸,是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物同時也是厭氧發(fā)酵中碳代謝的終端還原性產(chǎn)物之一,作為一種重要的化工原料和中間體,廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)[1]。相對于化學(xué)合成法,生物法[2-5]合成丁二酸由于消耗低、污染小、反應(yīng)溫度等優(yōu)點,已成為近年來研究的熱點[6-7]。

        大腸桿菌 AFP111是有氧-厭氧兩階段生產(chǎn)丁二酸的潛力菌株[8]。Vemuri等[9]研究了有氧轉(zhuǎn)厭氧時間節(jié)點對菌體產(chǎn)丁二酸的影響,姜岷等[10]通過有氧階段碳限制策略提高細胞活力,使AFP111產(chǎn)丁二酸量達到101.2 g/L。但是,隨著厭氧發(fā)酵時間的延長,菌體的活力不斷降低[11],菌體的產(chǎn)酸速率也不斷下降。Andersson等[12]在發(fā)酵過程中通過去除產(chǎn)物丁二酸來保持菌體的高產(chǎn)酸能力,結(jié)果表明整個 100 h的厭氧發(fā)酵過程中丁二酸產(chǎn)量提高達60%以上。然而丁二酸生產(chǎn)效率明顯降低。文中通過有氧誘導(dǎo)回收的菌體細胞,提高菌體轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)酸能力,進一步提高轉(zhuǎn)化過程中丁二酸的產(chǎn)量及生產(chǎn)效率。

        1 材料與方法

        1.1 菌株

        大腸桿菌 Escherichia coli AFP111 [F+λ-rpoS396 (Am)rph-1 △(pflAB::Cam)ldhA::Kan 95ptsG]由 David P.Clark 教授 (Southern Illinois University)惠贈。

        1.2 方法

        1.2.1 種子培養(yǎng)基

        有氧搖瓶培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.0,氯霉素添加量為25 μg/mL,硫酸卡那霉素添加量 30 μg/mL。

        JSM培養(yǎng)基參考文獻[13]。

        血清瓶培養(yǎng)基:JSM培養(yǎng)基如前所述。JSM-P培養(yǎng)基為在JSM培養(yǎng)基中去除磷酸鹽,JSM-N培養(yǎng)基為JSM培養(yǎng)基中去除銨鹽,JSM-T培養(yǎng)基為在JSM培養(yǎng)基中去除微量元素,JSM-B培養(yǎng)基為在JSM培養(yǎng)基中去除生物素和VB1,BM培養(yǎng)基為只含無菌水培養(yǎng)基。

        1.2.2 種子培養(yǎng)

        將保存于–80 ℃凍存管中的菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為 5 mL的試管中,37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后,以1%的接種量接種到裝液量為100 mL的500 mL搖瓶中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h。

        1.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)

        將種子液以10%的接種量接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的 7.5 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter;New Brunswick ScientificCo., Edison, N.J.),初糖濃度為30 g/L,12.5%的氨水調(diào)節(jié)pH 6.8, 37 ℃有氧培養(yǎng)至初糖耗盡,流加800 g/L葡萄糖,控制菌體的相對生長速率為0.7 h–1至OD600=60;厭氧階段,無菌過濾條件下通二氧化碳氣體,通氣量0.5 L/min,25%的 Na2CO3調(diào)節(jié) pH 6.6,厭氧發(fā)酵 60 h。

        1.2.4 細胞離心回收與轉(zhuǎn)化發(fā)酵

        兩階段發(fā)酵結(jié)束,收集發(fā)酵液,離心(5 000 r/min,10 min,4 ℃)獲得細胞,用雙蒸水懸浮后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐進行轉(zhuǎn)化實驗。有氧誘導(dǎo)3 h后,厭氧發(fā)酵條件同上。

        1.3 分析

        細胞生物量OD600,菌體干重,葡萄糖濃度,有機酸濃度參考文獻[14],酶活參考文獻[15]。

        2 結(jié)果

        2.1 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的優(yōu)化

        有氧-厭氧兩階段生產(chǎn)丁二酸時,有氧階段使用JSM培養(yǎng)基主要提供菌體生長所需營養(yǎng)元素,用于菌體細胞生長,而在厭氧轉(zhuǎn)化過程中,菌體主要利用葡萄糖進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸,菌體密度不會增長[9],JSM 培養(yǎng)基中成分更多起到緩沖鹽作用。因此,優(yōu)化轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分對菌體產(chǎn)酸以及發(fā)酵成本降低是十分重要的。

        由表1可知,發(fā)酵整個過程BM培養(yǎng)基中菌體DCW降低最大,達到1.6 g/L,其余培養(yǎng)基中菌體DCW變化較小。各個組分的培養(yǎng)基中菌株耗糖,副產(chǎn)物乙酸量相差不大。當 BM 培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基時,丁二酸得率最高,達到 93%,且單位細胞生產(chǎn)率相比于JSM培養(yǎng)基只降低了0.9%,所以采用BM培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)基。

        2.2 有氧誘導(dǎo)時間對菌體轉(zhuǎn)化的影響

        隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加,菌體的產(chǎn)酸速率逐漸降低,而通過空氣進行有氧誘導(dǎo)可以部分恢復(fù)菌體中一些關(guān)鍵酶如異檸檬酸裂解酶[15-16]等活力,以利于菌體進行下一次轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)酸。故進行了0 h、1 h、3 h和5 h 四個不同有氧誘導(dǎo)時間梯度對菌體產(chǎn)酸的考察。由圖1表明,在0~3 h范圍內(nèi),菌體凈產(chǎn)酸量 (去除厭氧開始時殘留的丁二酸量)和總產(chǎn)酸量隨著有氧誘導(dǎo)時間的增長而增加,而繼續(xù)提高有氧誘導(dǎo)時間至 5 h并沒有繼續(xù)增加菌體產(chǎn)酸的能力,故選擇3 h為最佳有氧誘導(dǎo)時間。

        由表2可知,3 h誘導(dǎo)后磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC),蘋果酸脫氫酶 (MDH)酶活相較于無誘導(dǎo)條件下分別提高了 31%和 46%,有利于還原性TCA循環(huán)支路產(chǎn)丁二酸,而異檸檬酸裂解酶 (ICL)酶活增加了7倍,表明乙醛酸途徑得到了加強,從而有利于丁二酸的生成,使丁二酸的產(chǎn)量提高。

        表1 厭氧血清瓶發(fā)酵后參數(shù)的測定結(jié)果Table 1 Results of these parameters on anaerobic fermentation in sealed bottles

        圖1 不同有氧誘導(dǎo)時間對菌體產(chǎn)酸的影響Fig. 1 Effect of different aerobic time on the final succinic acid concentration. Net succinic acid equals final succinic acid concentration minus initial succinic acid concentration;total succinic acid equals final concentration.

        2.3 連續(xù)轉(zhuǎn)化發(fā)酵

        發(fā)酵罐厭氧發(fā)酵 60 h,丁二酸產(chǎn)量達到68.01 g/L,單位生產(chǎn)率為112.88 mg/(g·h)。此時通過離心收集菌泥,用無菌水洗滌稀釋OD600至60進行有氧誘導(dǎo),結(jié)束后開始重新發(fā)酵。由表3可知,重新發(fā)酵后丁二酸產(chǎn)量分別為55.9 g/L和45.6 g/L,單位菌體的生產(chǎn)速率分別為92.84 mg/(g·h)和 76.30 mg/(g·h)。整個過程 (菌體有氧生長時間計算在內(nèi))產(chǎn)酸速度達到0.81 g/(L·h),相比于無有氧誘導(dǎo)條件下發(fā)酵時的產(chǎn)酸速度0.72 g/(L·h)提高了13%,總產(chǎn)量提高了19 g/L。

        表2 厭氧發(fā)酵開始時酶活的測定Table 2 Enzyme activities of cells at the beginning of anaerobic succinate production

        表3 發(fā)酵結(jié)果各參數(shù)的測定Table 3 Result of parameters on anaerobic fermentation

        [1]Willke T, Cukalovic KD. Industrial bioconversion of renewable resources as an alternative to conventional chemistry. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 66(2):131–142.

        [2]Lee PC, Lee SY, Hong SH, et al. Batch and continuous cultures of Mannheimia succinicproducens MBEL55E for the production of succinic acid from whey and corn steep liquor. Bioprocess Biosyst Eng, 2003, 26(1): 63–67.

        [3]Clark DP. The fermentation pathways of Escherichia coli. FEMS Microbiol Rev, 1989, 63(3): 223–234.

        [4]Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Sobolevskaya TI, et al.Production of succinic acid at low pH by a recombinant strain of the aerobic yeast Yarrowia lipolytica.Biotechnol Bioeng, 2010, 107(4): 673–682.

        [5]Lee PC, Lee WG, Lee SY, et al. Fermentative production of succinic acid from glucose and corn steep liquor by Anaerobiospirillum succiniciproducens. Biotechnol Bioprocess Eng, 2000, 5(5): 379–381.

        [6]Cukalovic A, Stevens CV. Feasibility of production methods for succinic acid derevatives: a marriage of renewable resources and chemical technology. Biofuels Bioprod Biorefin, 2008, 2(6): 505–529.

        [7]Song H, Lee SY. Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enzyme Microb Technol, 2006,39(3): 352–361.

        [8]Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(4):1715–1727.

        [9]Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time on transition from aerobic to anaerobic conditions.J Ind Microbiol Biot, 2002, 28(6): 325–332.

        [10]Jiang M, Liu S, Ma J, Chen K, et al. Effect of growth phase feeding strategies on succinate production by metabolically engineered E. coli. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(4): 1298–1300.

        [11]Warnecke T, Gill RT. Organic acid toxicity, tolerance,and production in Escherichia coli biorefining applications. Microb Cell Fact, 2005, 4: 25.

        [12]Andersson C, Petrova E, Berglund K, et al. Maintaining high anaerobic succinic acid productivity by product removal. Bioprocess Biosyst Eng, 2010, 33(6): 711–718.

        [13]Lu S, Eiteman MA, Altman E. Effect of CO2on succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentation. J Biotechnol, 2009, 143(3): 213–223.

        [14]Liu RM, Ma JF, Liang LY, et al. Effect of overexpression of nicotinic acid phosphoribosyl transferase on succinic acid production in Escherichia coli NZN111. Chin J Biotech, 2011, 27(10): 1438–1447(in Chinese).劉嶸明, 馬江峰, 梁麗亞, 等. 過量表達煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶對大腸桿菌 NZN111產(chǎn)丁二酸的影響. 生物工程學(xué)報, 2011, 27(10): 1438–1447.

        [15]Wu H, Li ZM, Li Z, et al. Improved succinic acid production in the anaerobic culture of an Escherichia coli pflB ldhA double mutant as a result of enhanced anaplerotic activities in the preceeding aerobic culture.Appl Microbiol Bitotechnol, 2007, 73(24): 7837–7843.

        [16]Wui H, Li ZM, Zhou L, et al. Enhanced anaerobic succinic acid production by Escherichia coli NZN111 aerobically grown on gluconeogenic carbon sources.Enzyme Microb Technol, 2009, 44(3): 165–169.

        猜你喜歡
        丁二酸產(chǎn)酸發(fā)酵罐
        餐廚廢水和固渣厭氧發(fā)酵試驗研究
        發(fā)酵罐不銹鋼換熱盤管泄漏失效分析
        薄荷復(fù)方煎液對齲病及牙周病常見致病菌生理活性的抑制作用
        產(chǎn)酸沼渣再利用稻秸兩級聯(lián)合產(chǎn)酸工藝研究
        丁二酸對化學(xué)鍍Ni-P-納米TiO2復(fù)合鍍層性能的影響
        利用計算流體力學(xué)技術(shù)分析啤酒發(fā)酵罐構(gòu)型對溫度和流動的影響
        芍藥總多糖抑齲作用的體外研究
        聚丁二酸丁二醇酯/淀粉共混物阻燃改性的研究
        中國塑料(2016年1期)2016-05-17 06:13:05
        阻燃聚丁二酸丁二醇酯復(fù)合材料的制備及其阻燃性能研究
        中國塑料(2016年11期)2016-04-16 05:25:58
        聚丁二酸丁二酯的酶促降解研究
        中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:47
        欧美高大丰满freesex| 日本丰满少妇xxxx| 69一区二三区好的精华| 久久精品国产亚洲av成人| 两个人免费视频大全毛片| 国内偷拍精品一区二区| 丁香婷婷激情综合俺也去| 欧美v亚洲v日韩v最新在线| 九九99久久精品午夜剧场免费| 人妻少妇被猛烈进入中文| 中国少妇×xxxx性裸交| 日韩无套内射视频6| av草草久久久久久久久久久| 少妇精品揄拍高潮少妇桃花岛| 精品国产第一国产综合精品| 成人做爰69片免费看网站| 亚洲AV专区一专区二专区三| 丝袜美腿人妻第一版主| 亚洲国产av玩弄放荡人妇| 欧美喷潮系列在线观看| 性一交一乱一乱一视频亚洲熟妇| 日韩精品视频久久一区二区| 无码ol丝袜高跟秘书在线观看| 无码毛片高潮一级一免费| 日韩产的人妻av在线网| 少妇高潮惨叫久久久久电影69| 欧美mv日韩mv国产网站| 国产在线AⅤ精品性色| 日本五十路人妻在线一区二区| 日本怡春院一区二区三区| 久久人妻AV无码一区二区| 国产少妇露脸精品自拍网站| 中文字幕在线观看| 亚洲国产区男人本色| 日韩av一区在线播放| 蜜臀一区二区三区精品| 国产婷婷一区二区三区| 亚洲αv在线精品糸列| 国产精品精品国产色婷婷| 久久国内精品自在自线图片| 婷婷色国产精品视频一区|