★ 熊瑛 張吉翔 湯蕾

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330006)

人XPD基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)影響*

★ 熊瑛1張吉翔1**湯蕾2

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330006)

目的：XPD基因作為TFIIH因子中一員，在基因修復(fù)中發(fā)揮重大作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白表達(dá)人野生型XPD基因重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞，探討XPD基因與HBx,Cdk7的相互作用，以及細(xì)胞周期和凋亡機(jī)制。方法：從人宮頸鱗癌上皮細(xì)胞株HeLa細(xì)胞克隆出人全長XPD cDNA，構(gòu)建了pEGFP-N2-XPD重組體質(zhì)粒，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入Hep3B并篩選單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Hep3B細(xì)胞(Hep3B-pEGFP-N2/XPD)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒Hep3B細(xì)胞(Hep3B-pEGFP-N2)。利用熒光顯微鏡觀測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染XPD基因后細(xì)胞內(nèi)XPD,HBx,Cdk7的表達(dá)量變化，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖凋亡以及細(xì)胞周期變化。結(jié)果：(1)利用酶切和基因測(cè)序，成功構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白表達(dá)人野生型XPD基因重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD。(2)免疫熒光顯微鏡下，Hep3B-pEGFP-N2和Hep3B-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞中可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)。(3)RT-PCR檢測(cè)：Hep3B-pEGFP-N2/XPD細(xì)胞與Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2，兩對(duì)照組相比,HBx mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.001)XPD mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)Cdk7 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.001)。(4)MTT檢測(cè)示Hep3B-pEGFP-N2/XPD與兩對(duì)照相比，細(xì)胞增殖率減弱(P<0.05)。TUNEL檢測(cè)示Hep3B-pEGFP-N2/XPD與兩對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示Hep3B-pEGFP-N2/XPD進(jìn)入S期出現(xiàn)障礙，停滯在G0+G1期的細(xì)胞增多，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。(5)Western blot檢測(cè)Hep3B-pEGFP-N2/XPD細(xì)胞中XPD蛋白相對(duì)表達(dá)量均比兩對(duì)照組高，Cdk7蛋白相對(duì)表達(dá)量均比兩對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).結(jié)論：野生型XPD基因片段成功插入pEGFP-N2空載質(zhì)粒中，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)人肝癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞中，可以在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平提高細(xì)胞XPD表達(dá)、降低細(xì)胞內(nèi)HBx Cdk7表達(dá)。野生型XPD基因過渡表達(dá)可能抑制HBx Cdk7表達(dá)來改變細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞生長、促使細(xì)胞凋亡。

肝臟腫瘤；XPD HBx；CDK7

原發(fā)性肝癌的形成是多基因參與下多步驟逐漸演變的過程，其中涉及基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)水平和基因功能等改變。人類XPD基因位于19q13.2-3,編碼一個(gè)具有ATP依賴的DNA螺旋酶活性的蛋白。[1]XPD蛋白是哺乳動(dòng)物基本轉(zhuǎn)錄因子IIH(transcription factor IIH,TFIIH)復(fù)合物的第二大亞基，在核苷酸切除修復(fù)過程中，它負(fù)責(zé)從5'→3'方向打開受損位置的DNA雙鏈，從而允許損傷特異性核酸酶從兩側(cè)切下受損DNA，在轉(zhuǎn)錄過程中，XPD的作用是維持TFⅡH復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性的放大。它的功能受阻可導(dǎo)致突變的基因不能得到有效的修復(fù),同時(shí)也會(huì)干擾一些調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡因子的功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞正常生長和凋亡改變。[2]乙肝病毒X蛋白(Heptitise B type X protein ,HBx蛋白)是乙型肝炎病毒HBV合成的蛋白質(zhì)，是促使肝癌發(fā)生的重要因素。HBx對(duì)NER的抑制可能是通過包括依賴與非依賴p53的多個(gè)途徑進(jìn)行的。[3]細(xì)胞周期依賴激酶7(Cycline Dependent Kinase 7 ,Cdk7)在細(xì)胞內(nèi)參與cdk激酶活性的調(diào)控，同時(shí)也為RNA轉(zhuǎn)錄的起始和延長所必需，抑制其功能可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展產(chǎn)生抑制作用，XPD突變可阻礙Cdk7對(duì)某些細(xì)胞核受體的磷酸化作用，使細(xì)胞對(duì)激素的敏感性下降。[4]

筆者克隆了人XPD基因，構(gòu)建pEGFP-N2-XPD重組表達(dá)質(zhì)粒并將野生型XPD基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人類肝癌細(xì)胞Hep3B，并檢測(cè)XPD,HBx,CDK7表達(dá)情況來探討它們之間的相互作用，并觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞發(fā)生的生物學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人宮頸鱗癌上皮HeLa細(xì)胞以及肝臟腫瘤細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞均來自于美國ATCC,10%FBS(四季青，杭州),DMEM(GIBCOTM，US),培養(yǎng)基10%FBS(GIBCOTM，certified,US),MEM(GIBCOTM，USA),Trizol試劑(Invetrogen,US.),SuperstcriptTM試劑盒(Invetrogen,US.),BglⅡ和KpnⅠTaq酶SphⅠ(TaKaRa公司,Japan),T4DNA連接酶(Promega,US.) ,卡那霉素(TaKaRa公司,Japan),脂質(zhì)體(lipofectamine 2000TM，Invetrogen,US.) ,G418(Geneticin418, Invetrogen,US),原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Promega,DesdEnd Colorimetric TUNEL System, Promega,US) ECL(Pierce,supersignal)試劑一抗(Santa Cluze,rabbit monoclonal antibody)HRP標(biāo)記二抗(山羊抗兔抗體，北京金衫)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞以及Hep3B細(xì)胞，分別在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基和含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化，2-3d傳代一次。

1.3 XPD基因克隆，重組質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增

1.3.1 總RNA提取，cDNA合成，全長XPD的PCR擴(kuò)增

HeLa細(xì)胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)路合成cDNA。根據(jù)Genebank中公布的人類XPD完整mRNA序列NM_000400.2，設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物的5'端分別加上BglⅡ和KpnⅠ的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物正義：5′-TTAGAATTCCATGAAGCTCAACGTG-3′，反義：5′-GAGTTAGCGGCTCTGTGTGTAG-3′在Taq酶的作用下,經(jīng)94℃1min預(yù)變性,94℃45s,54℃1min,72℃1min35循環(huán),72℃5min總延伸,擴(kuò)增出的目的條帶長度應(yīng)為約2300bp。

1.3.2 pEGFP-N2-XPD基因的酶切、連接、鑒定

將帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pEGFP-N2空載質(zhì)粒與純化后的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行KpnⅠ和BglⅡ的雙酶切,二者的酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳純化并回收后,XPD基因片段和pEGFP-N2載體片段以1-10:1摩爾比例,在T4DNA連接酶的作用下,置4℃16h進(jìn)行連接反應(yīng)。得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM-109，在含有終濃度為30μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上生長。長出的菌落單個(gè)挑出加入LB液體培養(yǎng)基置37℃16h，提取出重組質(zhì)粒以KpnⅠ、BglⅡ和SphⅠ酶切鑒定，并送上海生物工程有限公司測(cè)序。重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N2-XPD。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)設(shè)3組，分別為肝癌細(xì)胞無轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組Hep3B,空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組Hep3B-pEGFP-N2以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組Hep3B-pEGFP-N2/XPD。Hep3B以2×105細(xì)胞/孔的密度鋪6孔板內(nèi)24h細(xì)胞鋪滿50-80%，用1μL質(zhì)粒進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染96h后1：1傳代，G418篩選濃度為400μg/mL,挑選抗性細(xì)胞克隆種入96孔板中，挑取單克隆集落逐步擴(kuò)增后傳代培養(yǎng)。

1.5 RT-PCR測(cè)定基因表達(dá)量

提取各組細(xì)胞總RNA合成cDNA。根據(jù)Genebank中公布的人類XPDmRNA HBxmRNA Cdk7mRNA以及β-actin mRNA序列設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min, 94℃ 40s,退火溫度45s,72℃ 50s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min(詳見表1)。

表1 XPDmRNA HBxmRNA Cdk7mRNA以及β-actin mRNA引物序列 擴(kuò)增片段長度以及退火溫度

注：2組患者與治療前比較※P>0.05；2組患者治療后比較：△P<0.05。

10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，通過FR200圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的XPD、HBx、Cdk7的mRNA表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1.6.1 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)TUNEL法

將上述三組細(xì)胞分別種植于包被多聚賴氨酸的玻片上培養(yǎng)48h，爬片率約80%，預(yù)冷PBS洗滌，新鮮配置4%多聚甲醛固定。按照原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作，采用凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

收集上述各組處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，無水乙醇4℃固定過夜，Rnase A消化，碘化丙啶染色30min。應(yīng)用FACSCalibar(Beckton Dickinson ,USA)流式細(xì)胞儀，氬離子激光器激發(fā)波長為488nm，應(yīng)用Modifit3.0軟件分析結(jié)果。

1.6.3 MTT法檢測(cè)

上述3組細(xì)胞于對(duì)數(shù)期接種于96孔板中，每孔103個(gè)細(xì)胞，對(duì)照組只加培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入100μlDMSO,震蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定492nm處各孔A值，取每孔平均值。計(jì)算生長增殖率：生長增殖率=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組-1)。

1.7 蛋白表達(dá)檢測(cè)

使用三去污裂解液分別提取3組細(xì)胞的總蛋白，使用全自動(dòng)生化分析儀(Beckman, USA)測(cè)定蛋白濃度。取同量蛋白上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，繼而轉(zhuǎn)移蛋白于硝酸纖維素膜；膜于5%脫脂奶粉TBST中4℃封閉過夜，加封閉液稀釋的一抗1∶500過夜，用TBST洗膜3×15min，加封閉液稀釋HRP標(biāo)記二抗1∶10 004℃過夜，TBST洗膜3×30min，加ECL，X光膠片曝光，洗片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊使用卡方檢驗(yàn)，方差不齊使用秩和檢驗(yàn)，并應(yīng)用SPSS 12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-N2-XPD質(zhì)粒構(gòu)建

從HeLa細(xì)胞提取的總RNA經(jīng)RT-PCR后，擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示出一條約2 300bp的亮帶，符合預(yù)期結(jié)果。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，提取出的重組質(zhì)粒分別用KpnⅠ、BglⅡ和SphⅠ三種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，選用的pEGFP-N2質(zhì)粒長度為4737bp, XPD cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為2 300bp,因此重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ單酶切后電泳應(yīng)在約7 037bp位置有條帶，經(jīng)KpnⅠ和BglⅡ雙酶切后電泳應(yīng)在4 737bp位置和約2 300bp位置各有一條帶。此外，限制性核酸內(nèi)切酶SphⅠ在pEGFP-N2純質(zhì)粒的2 332bp，2 404bp，3 167bp位置和XPD的636bp位置各有一酶切位點(diǎn)，同時(shí)XPD是在pEGFP-N2質(zhì)粒的612bp和652bp之間以正義方向插入，所以重組質(zhì)粒經(jīng)SphⅠ單酶切后電泳應(yīng)包括2 818bp,3 344bp,763bp和72bp的位置的4條帶。將構(gòu)建的pEGFP-N2-XPD送至上海申工檢測(cè)，獲得直接測(cè)序報(bào)告。

圖1-1 Hep3B細(xì)胞

圖1-2 Hep3B-pEGFP-N2細(xì)胞

圖1-3 Hep3B-pEGFP-N2/XPD細(xì)胞

2.2 質(zhì)粒的真核表達(dá)

pEGFP-N2載體在其多克隆位點(diǎn)后帶有綠色熒光蛋白報(bào)導(dǎo)基因。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將pEGFP-N2和pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hep3B細(xì)胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到了細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，未轉(zhuǎn)染的純Hep3B細(xì)胞則沒有(見圖4)。

2.3 pEGFP-N2以及pEGFP-N2-XPD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功篩選后各組細(xì)胞HBxmRNA,Cdk7mRNA，XPDmRNA及其蛋白表達(dá)量的變化。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選成功后，3組細(xì)胞分別進(jìn)行RT-PCR結(jié)果。結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型XPD后，Hep3B細(xì)胞內(nèi)XPD表達(dá)明顯增高,HBx,Cdk7表達(dá)明顯下降。

將曝光后的X光膠片通過通過FR200圖像分析軟件讀取目的條帶的測(cè)得的激光光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的Cdk7,XPD的蛋白表達(dá)量，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型XPD后，Hep3B細(xì)胞內(nèi)XPD表達(dá)明顯增高,CDK7表達(dá)明顯下降(P<0.01)，而空白對(duì)照組以及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組則沒有顯著性差異(P>0.05)(見圖2)。

圖2

2.4 pEGFP-N2以及pEGFP-N2-XPD轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Hep3B-pEGFP-N2-XPD增殖有了明顯變化，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Hep3B-pEGFP-N2和空白對(duì)照組細(xì)胞Hep3B相比，Hep3B-pEGFP-N2-XPD明顯減少。

MTT分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理顯示：以Hep3B細(xì)胞組生長率為1，Hep3B-pEGFP-N2細(xì)胞組為1.041±0.125，Hep3B-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞組為0.72±0.112，Hep3B-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞組的吸光度與其他2組比較明顯下降，存在顯著差異(P<0.05);Hep3B-pEGFP-N2細(xì)胞組與Hep3B細(xì)胞組相互比較沒有顯著性差異(P>0.05)。這說明XPD降低了Hep3B細(xì)胞代謝，抑制了Hep3B細(xì)胞的增殖。

TUNEL法進(jìn)行凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：Hep3B細(xì)胞組Hep3B-pEGFP-N2細(xì)胞組凋亡細(xì)胞數(shù)極少凋亡指數(shù)分別為9.12%+1.53%和10.11%+1.41%；Hep3B-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞組卻有大量細(xì)胞凋亡，其凋亡指數(shù)為26.3%+2.95%。與Hep3B細(xì)胞組和Hep3B-pEGFP-N2細(xì)胞組相比，Hep3B-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞組有極顯著差異性(P<0.01)(細(xì)胞核染棕色為凋亡細(xì)胞)。見圖3。

流式細(xì)胞儀分析，Hep3B空白對(duì)照細(xì)胞組和Hep3B-pEGFP-N2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組G0+G1期分別為52.18和53.00%，S期分別為和35.85%和35.08%,出現(xiàn)代表細(xì)胞凋亡的亞G1峰(其面積代表凋亡比例)分別為2.45%和2.52%；Hep3B-pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組G0+G1期為69.24%,S期為28.63%，亞G1峰為26.73%。因此Hep3B-pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)入S期出現(xiàn)障礙，停滯在G0+G1期的細(xì)胞增多，細(xì)胞凋亡率逐漸增加(見圖4)。

圖3 TUNEL法進(jìn)行凋亡檢測(cè)

圖4

3 討論

DNA作為一種重要的遺傳物質(zhì)，環(huán)境中的各種因素都可能使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而影響遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞。因此，各種生物體內(nèi)都有著一系列DNA修復(fù)程序，可以使受損的DNA得以恢復(fù)正常。如果某一修復(fù)途徑中的某個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生缺陷，則會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。[5-6]在著色性干皮病B和可卡恩綜合征的病人中XPB基因發(fā)生突變，導(dǎo)致DNA修復(fù)缺失，從而容易發(fā)生癌癥。XP，CS和TTD的病人中XPD基因發(fā)生突變，導(dǎo)致DNA修復(fù)缺失，從而致使癌癥發(fā)病率是正常人群的數(shù)千倍。[7-9]

人類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH(transcription factor IIH,TFIIH)是一個(gè)由九個(gè)亞基(XPB,XPD,p62,p52,p44,p34,cdk7,cyclinHT和MAT1)組成的復(fù)合體，其中XPB,p62,p52,p44和p34組成一個(gè)核心亞復(fù)合物，XPD與cdk7,cyclinHT和MAT1組成一個(gè)具有CDK活性的激酶(cdk active kinase,CAK)亞復(fù)合物。[10]TFⅡH在轉(zhuǎn)錄起始和NER中都發(fā)揮著重要作用，但XPD亞基在轉(zhuǎn)錄和修復(fù)中的作用卻是不同的。在核苷酸切除修復(fù)過程中，它可從5'→3'方向打開受損位置的DNA雙鏈，從而允許損傷特異性核酸酶從兩側(cè)切下受損DNA。而在轉(zhuǎn)錄起啟階段，XPD的作用是介導(dǎo)CAK錨定在TFⅡH核心亞復(fù)物上，并且與P44亞基的N端相互作用，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。有研究發(fā)現(xiàn)，XPD突變可阻礙cdk7對(duì)某些細(xì)胞核受體的磷酸化作用，使細(xì)胞對(duì)激素的敏感性下降。[11-12]

紫外線照射、吸煙和環(huán)境中的各種因素都可以使DNA發(fā)生各種損傷，如果這些損傷不能及時(shí)被清除并修復(fù)，累積將導(dǎo)致疾病的發(fā)生(例如腫瘤)。[13]因此，各種涉及DRC的基因如果發(fā)生突變，則有可能使腫瘤易感性增強(qiáng)。有研究者通過檢測(cè)某種基因型細(xì)胞的DNA加合物水平(adduct level,AL)來在判斷該突變與腫瘤發(fā)生危險(xiǎn)的關(guān)系。[14]XPD某些位點(diǎn)的突變，會(huì)降低細(xì)胞的NER活性，因此XPD各種基因型也被普遍研究。我們將野生型XPD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入Hep3B中，通過RT-PCR以及Western Blotting測(cè)定，Hep3B細(xì)胞是整合了HBx蛋白但不包含抑癌基因P53的人類肝癌細(xì)胞。HBx蛋白是乙型肝炎病毒HBV合成的蛋白質(zhì)，而后者是肝癌發(fā)生的重要因素。過去的研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白可以抑制p53序列特異性轉(zhuǎn)錄活性，從而破壞p53介導(dǎo)的凋亡、DNA修復(fù)和細(xì)胞周期。Jaitovich-Groisman I.等在體外和HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中都檢測(cè)到HBx對(duì)XPB和XPD基因轉(zhuǎn)錄的抑制，并且，表達(dá)HBx的細(xì)胞對(duì)紫外光和光學(xué)致癌劑(如黃曲霉毒素B1)更為敏感。[2]可以推測(cè)HBx通過抑制細(xì)胞的NER活性，引起大型DNA加合物的堆積，是它的致癌機(jī)制之一。雖然XPB和XPD都受p53調(diào)控，但無論P(yáng)53是否存在HBx都對(duì)NER產(chǎn)生影響，所以HBx對(duì)NER的抑制可能是通過包括依賴與非依賴P53的多個(gè)途徑進(jìn)行的。根據(jù)目前的研究推測(cè),XPD和HBx作用機(jī)制可能主要有以下3條:(1)直接作用:研究顯示,HBx蛋白能和許多細(xì)胞蛋白相互作用,其中就包括TF ⅡH, XPD作為TF ⅡH的亞單位,參與mRNA轉(zhuǎn)錄以及NER。Qadri等的研究指出,無論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn),HBx蛋白都能和TF ⅡH 結(jié)合,進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn),HBx蛋白主要是和TF ⅡH復(fù)合體中的XPD/ERCC2, ERCC3亞單位直接結(jié)合,主要參與調(diào)節(jié)DNA解螺旋酶功能。[15]另外,HBx蛋白還能直接刺激XPD的解螺旋酶活性。(2)間接作用:研究顯示,HBx蛋白能和單鏈DNA直接結(jié)合,影響單鏈DNA的解鏈活性,而已知XPD主要具有解螺旋酶活性,故HBx蛋白通過和單鏈DNA的結(jié)合,改變DNA結(jié)構(gòu),影響XPD和DNA的結(jié)合及發(fā)揮其解螺旋酶的活性,從而影響核苷酸切除修復(fù)的進(jìn)行。[16](3)P53介導(dǎo)的作用:P53是一種抑癌基因,有大量研究顯示,很多腫瘤(包括肝癌)的發(fā)生和P53基因的異常表達(dá)有關(guān)。研究顯示,HBx能和P53直接結(jié)合,抑制P53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性,抑制P53和XPD間的結(jié)合,從而影響核苷酸切除修復(fù)。[17]

作為TFIIH激酶亞單位，Cdk7參與了基本轉(zhuǎn)錄(通過磷酸化RNA聚合酶2最大亞單位的羧基區(qū)域)。作為Cdk活化激酶(CAK)的一分子，Cdk7亦可以磷酸化其他的Cdks,作為他們活化的的一個(gè)必須步驟。果蠅屬TFIIH成分XPD負(fù)性調(diào)節(jié)Cdk7調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能(即CAK活性)過量XPD驗(yàn)證CAK活性，導(dǎo)致CDK T 環(huán)磷酸化水平的下降，有絲分裂阻滯和細(xì)胞死亡，反之，XPD減少會(huì)導(dǎo)致CAK活性上升以及細(xì)胞增殖。[18-19]此外，在有絲分裂初期XPD水平被調(diào)節(jié)下降，當(dāng)CDK1(Cdk7的一個(gè)細(xì)胞周期靶基因)相當(dāng)活躍的時(shí)候。因此XPD調(diào)控下降可能歸咎于有絲分裂CAK活性的上調(diào)和有絲分裂過程的正性調(diào)節(jié)。同時(shí)，XPD下調(diào)可能是基本轉(zhuǎn)錄有絲分裂沉默的主要機(jī)制。XPB解螺旋酶對(duì)于轉(zhuǎn)錄是必需的，以打開起始位點(diǎn)附近的啟動(dòng)子，但是XPD解螺旋酶則不是必需的，對(duì)于刺激轉(zhuǎn)錄和CAK復(fù)合物靶定于TFIIH。同時(shí)，Cdk7在啟動(dòng)子解開缺失的情況下可以磷酸化RNA pol 2的羧基端區(qū)域。[20]Cdk7在細(xì)胞內(nèi)參與Cdk激酶活性的調(diào)控，同時(shí)也為RNA轉(zhuǎn)錄的起始和延長所必需，研究表明，在一些腫瘤組織中Cdk7表達(dá)異常增高，化療后，臨床療效與cdk7表達(dá)水平下降一致，[4]因此，我們認(rèn)為Cdk7可能在腫瘤發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，抑制其功能可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展產(chǎn)生抑制作用，是一個(gè)抗腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡進(jìn)行分析的結(jié)果可以證實(shí)沉默Cdk7導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡，大量細(xì)胞阻滯于G0/G1期可能是由到調(diào)亡發(fā)生的原因。利用投射電子顯微鏡技術(shù)也證明了凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型XPD后，Hep3B細(xì)胞內(nèi)XPD表達(dá)明顯增高,HBx,CDK7表達(dá)明顯下降，細(xì)胞增殖力減弱，凋亡增加。目前認(rèn)為TFIIH調(diào)節(jié)細(xì)胞周期主要通過CAK激酶功能，XPD可以負(fù)性調(diào)節(jié)Cdk7的細(xì)胞周期功能及CAK活性，從而影響細(xì)胞周期。

本實(shí)驗(yàn)只對(duì)XPD與相關(guān)基因的作用作了初步的探討。在今后的實(shí)驗(yàn)中尚需進(jìn)一步明確XPD基因與HBx,PUMA,CDKs,P53、P21waf1/cip1和c-Myc的關(guān)系以及抑制細(xì)胞生長和促使細(xì)胞凋亡機(jī)制，從而加以糾正；進(jìn)一步研究XPD基因與HBX的關(guān)系，為肝癌及其它惡性實(shí)體瘤的綜合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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BiologicalAlterationofHepatomaCellsTransfectedbyXPBinVitro*

XIONGYing,ZHANGJi-xiang**,TANGLei

1.ThekeylaboratoryofmolecularmedicineofJiangxiprovince,JiangxiNanchang330006;2.ThesecondaffiliatedhospitalofNanchangUniversity,JiangxiNanchang330006

Background & Objective:As a part of TFIIH ,XPD gene plays a key role in NER. To construct the recombinant plasmid pEGFP-N2-XPD and transfect the plasmid into the human hepatoma carcinoma cell line Hep3B. To investigate the role of wild-type XPD in cell cycle and apoptosis of hepatoma cells and its relationship with HBx and Cdk7.Methods:The human full length XPD was cloned by RT-PCR using the total RNA extracted from HeLa, and was inserted into the pEGFP-N2 plasmid vector which expression the green fluorescence protein(GFP). And then pEGFP-N2 and pEGFP-N2-XPD were transfected into Hep3B cell line by LipofectAMINE 2000 and selected in medium containing G418,400μg·mL-1for Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD; Cell lines for comparison were matched on the same genetic background and passage . The expression of wild-type XPD、HBx and Cdk7 were detected by RT-PCR and Western blot, cell growth was detected by MTT, TUNEL and FCM were employed for examining the cell cycle and apoptosis of the transfected Hep3B cells. Results:1.We have built the combinational plasmid pEGFP-N2-XPD . 2. Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD express the green fluorescence protein(GFP) which could be detected under the immunofluorescence microscope. 3.The relative expressin of HBx mRNA in Hep3B, Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD were：0.361±0.095、0.368±0.098、0.113±0.041； The relative expression of HBx mRNA in Hep3B-pEGFP-N2-XPD was significantly lower than the control Hep3B、Hep3B-pEGFP-N2. 4.The relative expression of XPD mRNA in the three cell lines were 0.635±0.095、0.233±0.090、0.209±0.098,respectively,those in Hep3B-pEGFP-N2-XPD was significantly higher in compared with the controls ,the difference was statistically significant(P<0.01). 5.The relative expression of Cdk7 mRNA in the three cell lines was 0.753±0.054 、0.816±0.053 、0.122±0.049 respectively,those in Hep3B-pEGFP-N2-XPD significantly lower than the two controls (P<0.001). 6.MTT's result shows that the proliferative ability of Hep3B-pEGFP-N2-XPD is much more decreased.Wild type XPD gene could change the cell cycle and induce apoptitise in vitro though the results of TUNEL and FCM. 7. Western blotting: the relative expressin of XPD protein in Hep3B, Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD was ：0.408±0.049、0.467±0.088 、0.782±0.108; the relative expressin of Cdk7 protein in the three cell group was: 0.114±0.074、0.112±0.037 、0.754±0.059. Compared with the two controls, those in Hep3B-pEGFP-N2-XPD was less with a significant difference (P<0.001).Conclusion Wild-type XPD could decrease the expression of HBx and Cdk7 and inhibit the activity of cell growth ,as well as change cell cycle and induce cell apoptosis in hepatoma cell line Hep3B in vitro.

Hepatoma XPD;Clone HBx;CDK7

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：30360037)。

**通訊作者：張吉翔,Tel：0791-86292706,E-mail:jixiangz@tom.com。

R735.7

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2013-10-12)