崔文明，劉鷺，張書文，逄曉陽，李紅娟，呂加平

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京，100193)

乳酸菌自溶現(xiàn)象在乳酸菌發(fā)酵制品中普遍存在，是菌體自發(fā)進(jìn)行的細(xì)胞溶解現(xiàn)象，被認(rèn)為是細(xì)菌在不利環(huán)境中維持自我菌群生存的一種保護(hù)機(jī)制［1］。細(xì)菌自溶與自溶酶密切相關(guān)，通常認(rèn)為自溶是由細(xì)菌內(nèi)自溶酶的失衡作用所引起。自溶過程中自溶酶對細(xì)胞壁的水解作用會導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂而出現(xiàn)孔洞，致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物流失［2］。

乳酸菌自溶過程中釋放的胞內(nèi)蛋白酶、肽酶、酯酶等酶類，可將蛋白、多肽和脂肪分解成不同的風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，從而形成發(fā)酵制品的特殊風(fēng)味和口感［3］。一般情況下，發(fā)酵劑菌株自溶對發(fā)酵制品的品質(zhì)形成起著積極作用。以干酪生產(chǎn)為例，比較高自溶菌株Lactobacillus lactissubsp．cremorisAM2 與低自溶菌株Lactobacillus lactissubsp．cremorisHP 生產(chǎn)的切達(dá)干酪品質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，前者沒有苦味且風(fēng)味濃郁，而后者則苦味明顯，且風(fēng)味物質(zhì)種類顯著少于前者［4］。由于干酪成熟過程中產(chǎn)生的良好風(fēng)味主要依賴于乳酸菌自溶所釋放酶的水解作用，所以釋放酶的種類及數(shù)量將決定著干酪成熟周期長短和風(fēng)味優(yōu)劣［5-6］，表明發(fā)酵劑菌體快速自溶在一定程度上有利于促進(jìn)干酪成熟。然而，當(dāng)發(fā)酵劑菌體自溶速率過快時，會導(dǎo)致發(fā)酵制品產(chǎn)酸不足、凝乳不良及乳糖殘留過多等問題而影響產(chǎn)品的品質(zhì)和得率［7］。

鑒于乳酸菌自溶在發(fā)酵乳制品中的普遍性、重要性，而自溶酶調(diào)控自溶的相關(guān)機(jī)制尚不清晰的現(xiàn)狀，本研究主要以保加利亞乳桿菌LJJ 菌株為研究對象，考察菌體溫育溫度、溫育時間、環(huán)境pH、菌體生長階段、SDS 濃度，Triton X-100 濃度對菌體自溶特性及溶菌酶活性、自溶過程的菌體形態(tài)變化的影響規(guī)律，以期初步解釋乳酸菌自溶的誘發(fā)原因和自溶規(guī)律，為更進(jìn)一步探討乳酸菌的自溶機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp．bulgaricus)LJJ(本實驗室分離保存);EDTA，HCl(分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司)、十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純，北京拜爾迪生物有限公司)、Tris Base(Angus Chemical Company)、MRS 培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，溶菌酶檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW220 電子天平，日本 Shimadzu 公司;UV2300 分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司;DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DL-CJ-IN 高性能無菌試驗臺，哈爾濱市東聯(lián)公司;LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;JY92-ⅡN 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;S-3400N 型掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 方法

1．3．1 菌株保藏及培養(yǎng)基制備

保存于-20℃冰箱的凍干菌粉，經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基于37℃條件下活化3 次以上，然后儲存于4℃冰箱備用。MRS 液體培養(yǎng)基按照商品說明書所示比例配制，115℃滅菌20 min。

1．3．2 菌體培養(yǎng)、收集、洗滌及重懸

經(jīng)活化的實驗菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以4%(v/v)的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)至目標(biāo)菌體濃度后，離心(5 000 r/min，4℃，10 min)收集菌體。無菌生理鹽水懸浮洗滌菌體，重復(fù)洗滌3 次，無菌備用TE 緩沖液(50 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA)洗滌菌體1 次，懸浮收集菌體于適當(dāng)pH 的上述TE 緩沖液，備用。

1．3．3 自溶度的檢測方法

LJJ 菌懸液(OD600nm=0．4 ～0．6)，取適量去除菌體，測定上清液OD260nm，讀數(shù)記為A0。另取適量上述菌懸液置于培養(yǎng)箱溫育t h 后，取樣去除菌體，測定上清液OD600nm，讀數(shù)記為At。超聲波冰浴破碎(400 W，工作3 s，間隙3 s)剩余菌懸液至透明(表明菌體完全破碎)，取樣去除菌體，測定溶液OD260nm，讀數(shù)記為As。菌體自溶度計算:

1．3．4 菌體生長階段對其自溶度的影響

分別選取來自對數(shù)生長初期、中期、末期，生長穩(wěn)定期和生長末期的菌體細(xì)胞，重懸于pH 8．0 的緩沖液中于37℃下振蕩溫育24h，測定其自溶度。

1．3．5 不同pH 對菌體自溶度的影響

洗滌菌體分別重懸于pH 為2．0，4．0，5．0，6．0，7．0，8．0，10．0 的洗滌緩沖液中，于37℃，振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．6 溫度對菌體自溶度的影響

取對數(shù)生長期的菌體細(xì)胞，重懸于pH 8．0 的洗滌緩沖液中，分別置于4，25，37，50，60 和70℃環(huán)境中振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．7 SDS 濃度對菌體自溶的影響

取對數(shù)生長期菌體細(xì)胞重懸于pH 8．0 的洗滌緩沖液中，懸浮液中分別添加SDS 至終濃度為0．10，0．25，0．50 及1．00 g/L，置于37℃下振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．8 Triton X-100 濃度對菌體自溶的影響

取對數(shù)生長期菌體細(xì)胞，重懸于pH8．0 的洗滌緩沖液中，懸浮液中分別添加Triton X-100 至終濃度為0．25，0．50 及1．00 g/L，置于37℃下振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．9 掃描電鏡觀察

收獲處于對數(shù)生長期的菌體細(xì)胞，生理鹽水洗滌3 次，TE 緩沖液洗滌1 次后，取部分細(xì)胞，重懸浮于電鏡樣品固定液，備用。剩余樣品取一部分添加終含量0．50 g/L 的SDS 與剩余部分樣品置于37℃培養(yǎng)箱孵育24 h 后，離心收集菌體，重懸于電鏡樣品固定液。將正常細(xì)胞，24 h 自溶細(xì)胞和SDS 自溶細(xì)胞制備電鏡樣品后，置于掃描電鏡下觀察。

1．3．10 溶菌酶活力檢測

采用比濁度法，參見試劑盒使用說明書。

1．3．11 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Statistics Analysis System(SAS)9．2 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0．05 視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長階段LJJ 菌株自溶度的變化

圖1 結(jié)果顯示，隨著LJJ 細(xì)胞的不斷增殖，細(xì)胞自溶度逐步降低(未包括遲滯期，0 ～2 h)。對數(shù)生長期(4 ～14 h)細(xì)胞具有最大的自溶度，約為70．0%，整個對數(shù)生長期階段，生長中期(10 ～12 h)的細(xì)胞自溶度略高，但對數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞自溶度間無在統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異(P＞0．05)。穩(wěn)定期(20 ～32 h)細(xì)胞自溶度次之，約為43．0%，極顯著低于對數(shù)生長期自溶度(P＜0．01)。衰退期(36 ～45 h)細(xì)胞自溶度最低，一般低于20．0%且隨著時間的延長自溶度逐漸降低。來自對數(shù)生長期與穩(wěn)定期過渡區(qū)間(16 ～18 h)和穩(wěn)定期與衰退期過渡區(qū)間(32 ～34 h)的LJJ 細(xì)胞自溶度分別介于43．0% ～60．0% 和20．0% ～43．0%，且與來自對數(shù)生長期，穩(wěn)定期，衰退期的LJJ 細(xì)胞自溶度之間存在顯著性差異(P＜0．01)。

2.2 不同pH 對LJJ 菌株自溶的影響

研究結(jié)果表明，LJJ 菌株發(fā)生自溶的最適pH 為6．0 ～8．0。菌體自溶與環(huán)境pH 值關(guān)系密切，低酸性環(huán)境可顯著抑制乳酸菌的自溶。自溶8 h 時，LJJ 菌體自溶度隨著環(huán)境pH 升高而增大，彼此間差異顯著(P＜0．01)。自溶持續(xù)發(fā)生24h 時，除pH 5．0 菌懸體系的自溶度較低外，其余體系的自溶度開始趨于一致。當(dāng)自溶時間延長至96h 時，pH 6．0 環(huán)境體系中菌體自溶度反而高于pH 8．0 和pH 7．0 環(huán)境體系中的菌體自溶度(圖2 A)。環(huán)境pH 大于8．0 時，LJJ 自溶受到部分抑制，當(dāng)pH 大于或等于10．0 時，自溶受到顯著(P＜0．01)抑制(圖2B)。

圖1 來自不同生長階段的LJJ 菌株自溶度的變化Fig．1 The autolysis rate of LJJ from different growth phases

2.3 孵育溫度對LJJ 菌株自溶的影響

由圖3A 中所示，0 ～50℃，在相同溫育時間下，LJJ 的自溶度隨溫度升高而增大，同時到達(dá)自溶度趨于穩(wěn)定所需的時間也隨著溫度的升高而縮短。其中，環(huán)境溫度50℃時，96h 時的自溶度為90．6%，為4 個溫度水平中的最大自溶度，而且在12h 已基本達(dá)到最大，此時自溶度為81．3%顯著高于37℃時的46．8%(P＜0．01)。而圖3B 顯示，當(dāng)溫度升高至60℃以上時，LJJ 自溶度開始隨著溫度的升高而降低。

2.4 SDS 對LJJ 自溶的抑制作用

圖3 溫度對乳酸菌自溶的影響Fig．3 Effects of incubation temperature on the autolysis of LJJ

當(dāng)環(huán)境中存在SDS 時，LJJ 的自溶受到抑制。環(huán)境中SDS 濃度為0．10 g/L 時，乳酸菌自溶度即降為空白對照的約62．0%，且隨著懸浮體系中SDS 含量的增加，乳酸菌的自溶度逐漸降低，當(dāng)環(huán)境中SDS 濃度為0．50 g/L 時，乳酸菌的自溶幾乎被完全抑制，此時自溶度僅為對照的0．03%。因此，SDS 是乳酸菌LJJ 自溶的較強(qiáng)抑制劑(圖4A 所示)。如圖4B 所示，與商品溶菌酶試驗組對比，SDS 對商品自溶酶的抑制效果與LJJ 自溶抑制基本完全對應(yīng)，表明SDS 對LJJ自溶的抑制可能是通過抑制其自溶酶活性而實現(xiàn)的。

2.5 Triton X-100 對LJJ 自溶的影響

研究結(jié)果如圖5 所示，Triton X-100 的存在可促進(jìn)LJJ 自溶的發(fā)生并增強(qiáng)溶菌酶的活性，且隨著Triton X-100 濃度的增大，菌體自溶增速和酶活增強(qiáng)作用越明顯。當(dāng)環(huán)境體系中Triton X-100 添加量為1．0 g/L 時，LJJ 的自溶度相比對照增大了20．7%(溫育24h)(圖5A)，而溶菌酶的活性與空白對照相比提高了39．5%。比較圖5A 和圖5B，發(fā)現(xiàn)Triton X-100對溶菌酶酶活性的增強(qiáng)效果與加速LJJ 自溶的效果基本趨于一致。

2.6 掃描電鏡觀察LJJ 自溶中的細(xì)胞形態(tài)變化

圖4 SDS 濃度對LJJ 自溶與溶菌酶活力的影響Fig．4 Effects of SDS concentration on the autolysis of LJJ and lysmozye activity

圖5 Triton X-100 對LJJ 自溶和溶菌酶的影響Fig．5 Effects of Triton X-100 concentration on the autolysis of LJJ and lysmozye activity

對數(shù)生長期收獲的LJJ 菌體細(xì)胞，菌體完整飽滿，表面光滑(圖6A);而將正常LJJ 細(xì)胞于TE 緩沖液(pH8．0)中37℃下溫育24 h 后，LJJ 細(xì)胞的完整性遭到破壞，細(xì)胞發(fā)生不同程度的萎縮和凹陷，而且在細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞(圖6B)，胞內(nèi)內(nèi)容物也開始逐步釋放至周圍環(huán)境中。相同TE 緩沖液中添加終濃度0．50 g/L 的SDS 時，雖然LJJ 的細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度萎縮、凹陷和變形，但其細(xì)胞上并未出現(xiàn)明顯的孔洞(圖6C)，表明SDS 在一定程度上通過抑制自溶酶活性而抑制菌體自溶的發(fā)生。

圖6 LJJ 正常細(xì)胞與自溶細(xì)胞的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig．6 Electron micrographs showing the control cells and the autolysis cells of LJJ

3 討 論

3.1 乳酸菌的最適自溶條件

本研究確定的LJJ 的最適自溶條件為最適溫度50℃(0 ～50℃)，最適環(huán)境pH 6．0 ～8．0。該結(jié)果與李艾黎［8］等人和孫潔［9］等人分別研究的保加利亞乳桿菌KLDS 1．9201 和LD3 的最適自溶溫度55℃(0～55℃)，最適環(huán)境pH 5．5 ～7．5 和pH 6．0 ～7．0 基本一致。不同之處在于孫潔［9］等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境pH 7．5 時，自溶度就開始有所下降，而本研究發(fā)現(xiàn)雖然在最適pH 范圍內(nèi)的初始階段自溶度隨會隨著pH的升高而增大，但自溶24h 時，不同環(huán)境pH 下的自溶度趨于相同。此外，Kang［10］，馮鎮(zhèn)［11］等研究的干酪乳桿菌和乳桿菌LB-3 的最適自溶條件也處于相一致的溫度及pH 范圍。

對數(shù)生長期菌體細(xì)胞自溶度最大的結(jié)論與Kang［10］等人的研究結(jié)論一致，但Kang［10］等人的研究發(fā)現(xiàn)來自對數(shù)生長初中末期的菌體細(xì)胞的自溶度間也存在顯著性的差異與本研究存在不一致處。比較兩者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌體生長至OD600nm約為1．5時，此時菌體細(xì)胞表現(xiàn)出最大的自溶活性。

3.2 乳酸菌自溶與自溶酶

據(jù)報道細(xì)菌自溶是由細(xì)菌中存在的若干自溶酶引起，即自溶酶破壞細(xì)胞壁對細(xì)菌自溶發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［12-14］。

(1)最適自溶條件與乳酸菌自溶酶

LJJ 自溶的最適pH 和溫度范圍與自溶酶的最適作用條件一致。以研究較深入的溶菌酶［15-16］為例，其最適pH 范圍約在6．0 ～8．0，而最適作用溫度在65～75℃。當(dāng)溫度高于65℃以上時，其熱穩(wěn)定性開始降低，半衰期隨著溫度的升高快速減少。65℃時，溶菌酶半衰期大于3 h，75℃時半衰期則為45 min［17］。對比上述實驗結(jié)果，乳酸菌的自溶最適pH 范圍在6．0 ～8．0，與溶菌酶酶活的最適范圍pH 一致。自溶的最適溫度在60℃以下，低于溶菌酶的最適作用溫度，推測這是由于當(dāng)溶菌酶在較高溫度下短期內(nèi)的酶活雖有較大增強(qiáng)，但熱穩(wěn)定性開始降低。在孵育的24 h 內(nèi)，短時間的高酶活性的自溶效果要低于較低酶活性下長時間的自溶效果。

(2)不同生長階段自溶酶的變化規(guī)律

正常情況下，自溶酶對菌體細(xì)胞分裂作用是有序進(jìn)行的，不會導(dǎo)致菌體的自溶，而一旦在外界刺激下將導(dǎo)致作用失序而引起自溶［18］。此時自溶酶產(chǎn)量越多，自溶速率也越高。對數(shù)生長期細(xì)菌快速增殖，細(xì)胞生命活動活躍，負(fù)責(zé)分裂子母代細(xì)胞細(xì)胞壁的自溶酶得以大量產(chǎn)生，所以處于此階段的細(xì)胞在分離、洗滌、懸浮后最易發(fā)生自溶。細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于細(xì)菌菌體處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡中，細(xì)胞的活躍度顯著降低，自溶酶生成量減少，難以發(fā)生自溶。當(dāng)細(xì)菌生長進(jìn)入衰退期后，由于營養(yǎng)、環(huán)境等因素的制約，部分菌體開始裂解死亡，且負(fù)責(zé)破壞細(xì)胞壁的自溶酶的產(chǎn)量比穩(wěn)定期細(xì)胞有所增加［19］。

(3)乳酸菌自溶與自溶酶抑制劑和催化劑

SDS 對溶菌酶活性和對LJJ 自溶的抑制趨勢基本一致，Triton X-100 對溶菌酶活性和對LJJ 自溶的增強(qiáng)效果基本一致，均表明溶菌酶在LJJ 的自溶中起著重要作用。

已有的報道顯示，不同乳酸菌中自溶酶的種類及數(shù)量都各不相同［14，18］。因此，實現(xiàn)對LJJ 自溶的完全抑制，則需要對多種自溶酶同時存在抑制效果。而SDS 剛好是自溶酶中溶菌酶［20］、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶和部分內(nèi)肽酶的強(qiáng)抑制劑［20］。因此，SDS對乳酸菌自溶的抑制效果，是與其較廣較強(qiáng)的自溶酶抑制范圍相一致的，是SDS 對自溶酶酶活抑制作用的結(jié)果。Triton X-100 被廣泛應(yīng)用溶菌酶［21］，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶［22］于自溶酶酶譜分析的復(fù)性劑，其可以通過與變性蛋白的結(jié)合形成復(fù)合體，從而避免蛋白間聚合并在合適的條件下使蛋白正確折疊保持活性，從而在一定程度上起到催化自溶酶活性的效果［23］。

環(huán)境pH、溫度、SDS、Triton X-100 和不同生長階段等通過影響乳酸菌自溶酶活性而影響乳酸菌自溶。所以，通過調(diào)控乳酸菌自溶酶活性即可達(dá)到調(diào)控乳酸菌自溶的目的。

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