曲艷梅

(東北虎藥業(yè)股份有限公司,吉林 吉林 132013)

·論 著·

生命鉆石牌藏?？弟浤z囊增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)

曲艷梅

(東北虎藥業(yè)股份有限公司,吉林 吉林 132013)

目的生命鉆石牌藏福康軟膠囊增強(qiáng)免疫力功能檢測。方法健康雌性ICR小鼠，采用脾淋巴細(xì)胞增殖能力、抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清溶血素水平、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞活性及對脾臟/體重和胸腺/體重比值、足跖腫脹度試驗(yàn)等方法。結(jié)果與對照組比較，足跖腫脹度、脾臟/體重和胸腺/體重比值無顯著性差異；對脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，低、高劑量組抗體生成細(xì)胞數(shù)，高劑量組血清溶血素水平，高劑量組單核-巨噬細(xì)胞碳廓清吞噬指數(shù)，中、高劑量組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，高劑量組NK細(xì)胞活性均有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論本品經(jīng)免疫力功能測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示其具有增強(qiáng)免疫力的作用。

藏?？弟浤z囊;增強(qiáng)免疫力;功能實(shí)驗(yàn)

生命鉆石牌藏福康軟膠囊是以人參果[1-2]、刺五加[3-6]、小麥胚芽油[7-8]為主要原料制成，其保健功能為增強(qiáng)免疫力、提高缺氧耐受力功能。且經(jīng)毒理安全性評價(jià)實(shí)驗(yàn)證明其安全可靠?，F(xiàn)將增強(qiáng)免疫力功能檢測結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1樣 品由吉林市新科奇保健食品有限公司提供，為黃褐色液體。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，健康雌性ICR小鼠，體重18～22 g，批準(zhǔn)文號為SCXK(京)2002-0003，共192只，分為4組，免疫一組進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)；免疫二組進(jìn)行臟器/體重比值、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)、抗體生成細(xì)胞檢測及血清溶血素測定；免疫三組進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；免疫四組進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)。

1.3劑量選擇

生命鉆石牌藏?？弟浤z囊人體推薦量為每天3.0 g/(人·日)，按人均體重60 kg計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組，即：0.25 g/(kg·bw)、0.50 g/(kg·bw)、1.50 g/(kg·bw)，分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍。即稱取樣品0.50 g、1.0 g、3.0 g用植物油分別配至20 mL。溶劑對照組灌胃植物油，各組小鼠都按每天0.1 mL/(10 g·bw)劑量連續(xù)經(jīng)口灌胃30 d后，測各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1.4儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)、電子天平、數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精密度0.01 mm)，微量注射器(50 μL)、CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、顯微鏡、玻片架、200目篩網(wǎng)、手術(shù)器械、秒表、一次性定量取血管、24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。SRBC、補(bǔ)體(豚鼠血清)、Hanks液、SA緩沖液、瓊脂糖、印度墨汁、Na2CO3溶液、都式試劑、YAC-1細(xì)胞、RPM11640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰、INT、PMS、NAD、0.2 mol/L Tris-HCL緩沖液、1%NP40、ConA、1%冰醋酸、MTT液、酸性異丙醇、1 mol/L HCL溶液、PBS緩沖液、Giemsa染液等。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1DTH檢測:足跖增厚法

小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC，致敏后4 d測量左后足跖厚度，然后在測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC，每鼠注射20 μL，注射后24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取均值。以攻擊前后足跖厚度差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度。

1.5.2Con誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法)

無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用Hanks液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)，將細(xì)胞懸浮于1 mL RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作為對照，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，在570 nm波長處測定OD值，以加ConA孔的OD值減去不加ConA孔的OD值表示淋巴細(xì)胞增殖能力。

1.5.3小鼠臟器/體重比值及血清溶血素測定

小鼠臟器注射SRBC 5 d后，摘眼球取血，離心取血清稀釋100倍，進(jìn)行半數(shù)溶血值測定。然后處死動(dòng)物，取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算臟器/體重比值。同時(shí)制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行抗體生成細(xì)胞測定。

1.5.4抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法)

取脾，制成細(xì)胞懸液。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量雙倍Hanks液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內(nèi)加50 μL 10% SRBC(v/v，用SA液配制)、20 μL脾細(xì)胞懸液，迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將破片水平扣放在玻片架上，放入CO2培養(yǎng)箱溫育1.5 h，然后用SA液稀釋的補(bǔ)體(1∶8)加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5 h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.5.5小鼠碳廓清試驗(yàn)

小鼠尾靜脈注射1∶3稀釋的印度墨汁，待墨汁注入立即計(jì)時(shí)，注入墨汁后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL Na2CO3溶液中，用紫外可見分光光度計(jì)在600 nm波長處以Na2CO3溶液作空白對照測光密度值(OD)。將小鼠處死，取肝和脾臟稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.5.6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)

小鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，間隔30 min處死，固定于鼠板上，剪開腹壁皮膚，注射生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，分滴于2片玻片上，37 ℃溫育30 min，用生理鹽水漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa染液染色3 min，用蒸餾水漂洗晾干，用油鏡鏡檢，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率(%)=

1.5.7NK細(xì)胞活性測定

實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用Hanks液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水裂解紅細(xì)胞，20 s后再加入0.5 mL 2倍Hanks液及8 mL Hanks液，離心10 min(1 000 r/min)，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。將靶細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，試驗(yàn)孔加入100 μL脾細(xì)胞(效靶比50∶1)，自然釋放孔加入100 μL培養(yǎng)液，最大釋放孔加入100 μL 1%NP40，37 ℃培養(yǎng)4 h，離心，取上清100 μL置96孔酶標(biāo)板中，加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)6 min，以1 mol/L的HCL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀490 nm處測定值OD值。

NK細(xì)胞活性(%)=

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法(Dunnett檢驗(yàn)法)進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

軟膠囊對小鼠DTH的影響結(jié)果顯示，足跖腫脹度低劑量組(0.33 mm±0.10 mm)、中劑量組(0.33 mm±0.21 mm)、高劑量組(0.31 mm±0.16 mm)與對照組(0.25 mm±0.17 mm)比較無顯著性差異,P>0.05。

軟膠囊對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的影響結(jié)果顯示，淋巴細(xì)胞增殖能力(OD差值)低劑量組(0.50±0.09)、中劑量組(0.48±0.07)、高劑量組(0.46±0.10)與對照組(0.27±0.09)比較均有顯著性差異,P<0.05。

軟膠囊對小鼠臟器/體重比值的影響由結(jié)果可見，各劑量組對小鼠的脾臟/體重比值和胸腺/體重比值與對照組比較無顯著性差異P>0.05(表1)。

軟膠囊對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響結(jié)果顯示，溶血空斑數(shù)(×103/全脾)低劑量組(27±9)和高劑量組(23±9)與對照組(14±8)比較均有顯著性差異,P<0.05;中劑量組(18±7)與對照組比較無顯著性差異,P>0.05。

軟膠囊對小鼠血清溶血素的影響結(jié)果顯示，半數(shù)溶血值(HC50)高劑量組(60±15)與對照組(40±14)比較均有顯著性差異,P<0.05;低劑量組(57±19)和中劑量組(47±21)與對照組比較無顯著性差異,P>0.05。

軟膠囊對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力的影響結(jié)果顯示，吞噬指數(shù)(a)高劑量組(5.3±1.0)與對照組(4.5±0.5)比較均有顯著性差異,P<0.05;低劑量組(4.9±0.6)和中劑量組(4.9±0.6)與對照組比較無顯著性差異,P>0.05。

軟膠囊對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響結(jié)果顯示,中、高劑量組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，與對照組比較有顯著性差異,P<0.05(表2)。軟膠囊對小鼠NK細(xì)胞活性的影響結(jié)果顯示，NK細(xì)胞活性(%)高劑量組(65.8±17.0)與對照組(48.6±16.4)比較均有顯著性差異,P<0.05;低劑量組(62.3±12.7)和中劑量組(58.3±12.8)與對照組比較無顯著性差異,P>0.05。

軟膠囊對小鼠體重的影響結(jié)果顯示，小鼠的初始體重在低、中、高劑量組與對照組比較無顯著性差異,P>0.05，即小鼠的初始體重在各組之間較為均衡。而實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重增重在低、中、高劑量組與對照組比較無顯著性差異,P>0.05,即軟膠囊對小鼠體重?zé)o影響(表3)。

表 1 軟膠囊對小鼠臟器/體重比值的影響(n=12，g/100g)

表 2 軟膠囊對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

與對照組比較,*P<0.05

表 3 軟膠囊對小鼠體重的影響(n=12,g)

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生命鉆石牌藏?？弟浤z囊能提高小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力、增加抗體生成細(xì)胞數(shù)、提高血清溶血素水平、增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力、增強(qiáng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性；對脾臟/體重比值、胸腺/體重比值、足跖腫脹度無影響；提示生命鉆石牌藏?？弟浤z囊具有增強(qiáng)免疫力的作用。

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TheresearchofLifediamondzangfukangsoftcapsulesinenhancingimmunity

QU Yan-mei

(The Northeast Tiger Pharmaceutical Company,Jilin City,Jilin Province,132013，China)

ObjectiveTo detect the function of Life diamond zang fu kang soft capsules in enhancing immunity.MethodsThe healthy female ICR mice were applied in the observation of immunity function include the spleen lymphocyte proliferation,antibody generation,the level of serum hemolysin,the capacity of macrophage cell in abdominal cavity,mononuclear macrophage phagocytosis,the activity of NK cells,the spleen and thymus weight/body weight ratio,as well as foot metatarsus swelling degree.ResultsCompared with the control group,the capsules group has no significant difference in the foot metatarsus swelling degree,spleen and thymus weight/body weight ratio;For spleen lymphocyte transformation,the antibody generating cell number of low and high dose group,the serum hemolysin level of high dose group,the mononuclear-macrophages carbon clearance index of high dose group,and the index of phagocytosis macrophage cell in abdominal cavity rate of middle and high dose group,NK cell activity of high dose group were significantly different from the control group(P<0.05).ConclusionThis product can enhance the immunological function.

Life diamond zang fu kang soft capsules;enhancing immunity;detect the function

R285

A

2013-08-24)

1673-2995(2013)06-0419-04

曲艷梅(1973-)，女(漢族)，工程師，高級經(jīng)濟(jì)師,本科.