陳艷媛，廖慧娟，張 靈，郭亦然，朱優(yōu)鵬，方 芳

(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

·論 著·

RNA干擾CD147穩(wěn)定表達(dá)前列腺癌PC-3細(xì)胞株的建立

陳艷媛，廖慧娟，張 靈，郭亦然，朱優(yōu)鵬，方 芳*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

目的為研究CD147分子在前列腺癌PC-3細(xì)胞中的生物學(xué)功能，通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)建立穩(wěn)定低表達(dá)CD147分子的前列腺癌PC-3細(xì)胞株。方法利用脂質(zhì)體2000將靶向CD147干擾質(zhì)粒導(dǎo)入前列腺癌細(xì)胞中，干擾前列腺癌細(xì)胞中CD147分子的表達(dá)；有限稀釋法獲取單個(gè)細(xì)胞克隆，通過G418篩選出抗性克隆并利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和Western-blot免疫印跡法分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平進(jìn)行鑒定。結(jié)果與轉(zhuǎn)染pSilencer-Scramble對(duì)照質(zhì)粒比較，轉(zhuǎn)染pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒明顯抑制CD147基因和蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論靶向CD147的干涉載體能有效沉默PC-3細(xì)胞中CD147基因和蛋白的表達(dá)，通過G418篩選建立出穩(wěn)定細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究CD147的功能打下基礎(chǔ)。

RNA干擾；CD147；前列腺癌

前列腺癌(prostate cancer,PCa)已經(jīng)成為美國男性最為常見的惡性腫瘤，在男性因腫瘤引起死亡的疾病中，占據(jù)第二位。在國內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率也呈逐年升高的趨勢(shì)[1]。CD147是一種跨膜糖蛋白，在多種腫瘤中表達(dá)增高，其表達(dá)水平和腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。研究證實(shí)，與前列腺增生、正常和胚胎性前列腺組織相比，CD147在前列腺癌中異常高表達(dá)[2]；CD147的表達(dá)水平與PCa的TNM分期、Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，與癌細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)[3]。本研究利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將靶向CD147表達(dá)的RNAi質(zhì)粒導(dǎo)入前列腺癌PC-3細(xì)胞中，通過G418抗性篩選，建立穩(wěn)定低表達(dá)CD147的前列腺癌PC-3細(xì)胞，為進(jìn)一步指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究CD147的功能打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1材 料

pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒由吉林醫(yī)藥學(xué)院王立國博士贈(zèng)送；前列腺癌PC-3細(xì)胞購自ATCC。

進(jìn)口胎牛血清購自Gibco公司；RPMI1640購自SIGMA-ALDRICH公司；LipofectamineTM2000和G418購自美國Invitrogen公司；兔抗CD147和β-actin抗體購自GeneTex公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bradford法蛋白測定試劑盒均購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所；總RNA/mRNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒購自北京鼎國公司。

1.2G418篩選濃度的選擇

將培養(yǎng)好的PC-3細(xì)胞接種到96孔板中，接種量以第2天長成25%單層為宜，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日將培養(yǎng)液換成含G418培養(yǎng)液，G418濃度分別為0、50、100、200、400、600、800、1 000和1200 μg/mL。每2～3 d換液1次，觀察細(xì)胞在10～12 d全部死亡的G418濃度為G418壓力篩選濃度，正式篩選濃度高于該濃度一個(gè)級(jí)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明800 μg/mL培養(yǎng)12 d細(xì)胞全部死亡，因此篩選濃度為1 000 μg/mL。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞建立

轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞接種于24孔板中，第2天細(xì)胞長到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM2000操作手冊(cè)將pSilencer-Scramble質(zhì)粒(陰性對(duì)照)和pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC-3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后加入1 000 μg/mL G418培養(yǎng)2 d，將存活下的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，稀釋細(xì)胞濃度為1/100 μL，按照每個(gè)孔100 μL加入到96孔板中，鏡下檢測單孔單個(gè)細(xì)胞并標(biāo)記，加終濃度1 000 μg/mL的G418繼續(xù)培養(yǎng)。挑取在G418壓力篩選下存活的克隆，消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移細(xì)胞至24孔板中、繼續(xù)以G418培養(yǎng)，繼續(xù)將細(xì)胞擴(kuò)增至12孔板、6孔板和培養(yǎng)瓶中，獲得單克隆細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染pSilencer-Scramble質(zhì)粒的穩(wěn)定株命名為PC-3/Scramble細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染pSilencer-CD147質(zhì)粒的穩(wěn)定株命名為PC-3/shCD147細(xì)胞。

1.4RT-PCR檢測CD147基因表達(dá)

用總RNA/mRNA提取試劑盒提取總RNA，取細(xì)胞總RNA 1 μg，以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR方法檢測CD147在mRNA水平上的表達(dá)，并且以β-actin作為內(nèi)參。CD147引物為：CD147-forward 5′-aaggtggactccgacgaccagtgg-3′，CD147-reverse 5′-cttccggcgcttctcgtagatgaag-3′；β-actin引物為：β-actin-forward 5′-atcatgtttgagaccttcaaca-3′，β-actin-reverse 5′-catctcttgctcgaagtcca-3′。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用25 μL反應(yīng)體系。設(shè)置反應(yīng)條件94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后72 ℃ 10 min延伸。對(duì)擴(kuò)增基因在1.2%膠濃度并含EB的瓊脂糖上進(jìn)行電泳。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.5Western blot檢測CD147蛋白水平的表達(dá)

取30 g蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠上蛋白移至PVDF膜，于50 g/L脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗CD147(1∶1 000)，小鼠抗β-actin抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。TBST洗膜，分別加HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h。TBST洗膜后，加底物ECL發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果表明，與陰性對(duì)照PC-3(1.75±0.21)和pSilencer-Scramble(1.67±0.18)細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒組PC-3細(xì)胞中CD147 mRNA表達(dá)水平顯著下降(0.79±0.11)(P<0.05)(圖1)。

2.2Western Blot結(jié)果

與陰性對(duì)照PC-3(1.64±0.25)和pSilencer-Scramble(1.42±0.14)細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒組PC-3細(xì)胞中CD147蛋白表達(dá)水平顯著下降(0.58±0.08)(P<0.05)(圖2)，這同RT-PCR檢測結(jié)果相互對(duì)應(yīng)。

圖 1 RT-PCR鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株中CD147基因表達(dá)

圖 2 Western blot鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株中CD147蛋白表達(dá)

3 討 論

RNAi是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA(dsRNA)特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象，它通過人為的引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈的dsRNA，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的[4-5]。RNAi技術(shù)是基因功能和治療中的一種全新的研究手段。與傳統(tǒng)的基因研究和治療方式如反義寡核苷酸治療等相比，RNAi具有高特異性，識(shí)別可以精確到一個(gè)核苷酸[6-7]；以催化放大的方式抑制基因，比反義基因特異性和效率性高10倍以上[8]；具有高穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取相對(duì)容易、毒性小等優(yōu)點(diǎn)。

本研究利用RNAi技術(shù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)肭傲邢侔㏄C-3細(xì)胞中，觀察CD147在前列腺癌PC-3細(xì)胞的表達(dá)情況。常規(guī)含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，傳代后用pSilencer-Scramble質(zhì)粒(陰性對(duì)照)和pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞,先利用G418篩選出部分陽性細(xì)胞，再采用有限稀釋法挑選單個(gè)細(xì)胞克隆。經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)，RT-PCR、Western Blot檢測CD147在mRNA和蛋白水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PC-3細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染pSilencer-Scramble質(zhì)粒后，CD147的表達(dá)水平無明顯變化；轉(zhuǎn)染pSilencer-CD147干擾質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組可觀察到CD147在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著降低，證明在G418抗性篩選下建立了穩(wěn)定低表達(dá)CD147的PC-3細(xì)胞系。

綜上所述，運(yùn)用RNAi技術(shù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將外源基因?qū)肭傲邢侔㏄C-3細(xì)胞，我們成功篩選出CD147 RNAi穩(wěn)定前列腺癌PC-3細(xì)胞株。為進(jìn)一步指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究CD147的功能打下基礎(chǔ)，為臨床上前列腺癌的治療提供新的思路。

[1] Greenlee R T,Murray T,Bolden S,et al.Cancer statistics 2000[J].CA Cancer J Clin,2000,50(1):7-33.

[2] Zhong Weide,Liang Yuxiang,Lin S X,et al.Expression of CD147 is associated with prostate cancer progression[J].Int J Cancer，2012，130(2):300-308.

[3] 鄒 鈞，張 征,張 陽,等.CD147在前列腺癌組織中的表達(dá)及意義[J].中華泌尿外科雜志，2007，28(11)：763-765.

[4] Nyk?nen A,Haley B,Zamore P D.ATP requirements and small interferings RNA structure in the RNA interference pathway[J].Cell,2001,107(3):309-321.

[5] Matzke M,Matzke A J,Kooter J M.RNA:guiding gene silencing[J].Science,2001,293(5532):1080-1083.

[6] Bass B L.RNA interference.The short answer[J].Nature,2001,411(6836):428-429.

[7] Kawasaki H,Taira K.Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells[J].Nucleic Acids Res,2003,31(2):700-707.

[8] Nagy P,Arndt-Jovin D J,Jovin T M.Small interfering RNAs suppress the expression of endogenous and GFP-fused epidermal growth factor receptor(erbB1) and induce apoptosis in erbB1-overexpressing cells[J].Exp Cell Res,2003,285(1):39-49.

EstablishmentofCD147expressstableprostatecancerlinePC-3byRNAinterference

CHEN Yan-yuan,LIAO Hui-juan,ZHANG Lin,GUO Yi-ran,ZHU You-peng,FANG Fang*

(Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013，China)

ObjectiveTo study the biological behavior of CD147 in prostate cancer cellline PC-3,and establish the lower expression of CD147 stable prostate cancer line PC-3 by RNA interferenc.MethodsTargeting CD147 interference plasmid was transfected into prostate cancer PC-3 cell by the method of lipofectamine 2000.The single cell clones from limiting dilution were screened by G418 and the mRNA and protein expression were examined by RT-PCR and Western blot.ResultsCompared with cells transfected pSilencer-Scramble,cells transfected pSilencer-CD147 expression vector were inhibited both mRNA and protein expression of CD147(P<0.05).ConclusionSequence-specific RNAi vector targeting CD147 is capable of suppression CD147 gene and protein expression in prostate cancer PC-3 cell,which is the foundation for researching CD147 function.

RNA interference;CD147;prostate carcinoma

R737.25

A

2013-08-24)

1673-2995(2013)06-0404-03

吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目(201213).

陳艷媛(1989-)，女(漢族)，在讀本科.

方 芳(1973-)，女(漢族)，副教授，博士.