謝 楠，牟茂森，孫夢瑤，于 翔，高 寧，何慧敏，王曉靜，王綺軒，胥謹(jǐn)慧，胡妍妍，侯穎春

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062）

膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexins超基因家族中的成員，人類的ANXA2結(jié)構(gòu)基因位于15q21～q22．ANXA2由339個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為36kDa，由33kDa的C端結(jié)構(gòu)域和3kDa的N端結(jié)構(gòu)域組成．ANXA2主要以單體和異四聚體（ANXA22／p112）形式存在于人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中［1］．大量研究表明，ANXA2在多種類型的腫瘤中過表達(dá)，其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附、侵潤、增殖、遷移、凋亡等活動中起重要作用［2］．

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，ANXA2在人結(jié)直腸癌組織高表達(dá)，可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3］．RNA干擾（RNAi）技術(shù)是研究基因功能的重要方法之一，在腫瘤基因治療方面也具有很大潛力．該技術(shù)通過靶mRNA序列特異雙鏈小RNA分子（19－25bp）介導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的強(qiáng)有力阻斷［4］．本實驗以人結(jié)直腸癌細(xì)胞（Caco2）為研究對象，采用RNAi技術(shù)抑制Caco2細(xì)胞中的ANXA2基因表達(dá)，研究ANXA2表達(dá)對Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面與細(xì)胞運動密切相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為揭示ANXA2在結(jié)直腸癌時扮演的作用提供外觀形態(tài)學(xué)方面的資料，為以ANXA2為靶基因?qū)θ私Y(jié)直腸癌進(jìn)行基因治療積累實驗資料．

1 材料與方法

1．1 siRNA及其表達(dá)質(zhì)粒

Caco2細(xì)胞株購自美國ATCC；表達(dá)ANXA2特異性siRNA的質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2及錯義siRNA對照質(zhì)粒pU6H1－GFP－siRNASCR由百奧生物技術(shù)有限公司（南通）構(gòu)建合成．

siRNA序列由我們設(shè)計，ANXA2特異性siRNA序列：TGTGTGGTGGAGATGACTGA；

錯義對照siRNA序列：GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC．

1．2 實驗試劑及儀器

Endo－free Plasmid Mini Kit II為Omega產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素、鏈霉素、慶大霉素及胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品；STranG轉(zhuǎn)染試劑購自南京探求生物技術(shù)公司；電鏡級戊二醛固定液為Sigma產(chǎn)品．

DMIL LED倒置熒光顯微成像系統(tǒng)：德國徠卡公司；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭FEI公司；K850臨界點干燥儀：英國Emitech公司；E－1010離子濺射鍍膜儀：日本日立公司．

1．3 方法

1．3．1 質(zhì)粒制備 質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2及pU6H1－GFP－siRNASCR的制備參照Endo－free Plasmid Mini Kit II說明書進(jìn)行．

1．3．2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Caco2細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100μg／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、100μg／mL慶大霉素），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)．將對數(shù)生長期細(xì)胞以1．5×105個／皿接種于含有無菌蓋玻片的30mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁率達(dá)60%～70%時將質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2和pU6H1－GFP－siRNASCR分別以每皿4．5μg的用量導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)（S－TranG轉(zhuǎn)染試劑說明書）．設(shè)野生對照組（未轉(zhuǎn)染的Caco2）．每24h更換一次培養(yǎng)基．轉(zhuǎn)染60h后，用倒置熒光顯微鏡（激發(fā)光波長為488nm）檢測細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況以估算轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染效率＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)／視野下細(xì)胞總數(shù)×100%．

1．3．3 環(huán)境掃描電子顯微鏡制樣 分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120h在各組取出鋪有細(xì)胞的蓋玻片進(jìn)行掃描電鏡制樣：（1）用PBS洗3次，每次5 min；（2）2．5%電鏡級戊二醛4℃下固定60min；（3）預(yù)冷三蒸水洗3次，每次5min；（3）酒精逐級（30%，50%，75%，85%，95%，100%，100%）脫水，每級2min；（4）乙酸異戊酯置換乙醇；（5）臨界點干燥；（6）真空鍍金；（7）環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察，數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集．

2 結(jié)果

2．1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒60h后細(xì)胞GFP的表達(dá)如圖1所示．轉(zhuǎn)染效率＞80%．

圖1 轉(zhuǎn)染60h后Caco2細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)水平（×10）Fig．1 GFP expression in Caco2cells at 60hpost transfection

2．2 環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察

圖2Caco2細(xì)胞環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察Fig．2 ESEM images of Caco2cells

環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，野生對照組細(xì)胞整體形態(tài)豐滿，表現(xiàn)很好的貼壁狀態(tài)，細(xì)胞多成六邊形或多角形；細(xì)胞表面富致密的微絨毛；幾乎每個細(xì)胞都有發(fā)達(dá)的多而長的偽足自細(xì)胞膜處伸出到無細(xì)胞區(qū)，并與其它鄰近細(xì)胞伸出的偽足相互緊密嵌合或連接（圖2，A，B）．錯義對照組細(xì)胞（即轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siRNASCR的Caco2細(xì)胞）形態(tài)與野生對照組細(xì)胞基本一致，且隨時間延長到120h時細(xì)胞形態(tài)仍無明顯變化（圖2，C，D，E，F(xiàn)，G）．干擾組細(xì)胞（即轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2的Caco2細(xì)胞）形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)變化，而且這種變化隨時間延長愈加明顯．轉(zhuǎn)染24h后，干擾組細(xì)胞（圖2，H）與錯義對照組細(xì)胞（圖2，C）相比整體形態(tài)無顯著變化，但細(xì)胞表面微絨毛及偽足結(jié)構(gòu)均略有減少．轉(zhuǎn)染48h后，干擾組細(xì)胞（圖2，I）形態(tài)與錯義對照組細(xì)胞（圖2，D）相比出現(xiàn)較明顯變化，邊界變模糊，細(xì)胞表面微絨毛進(jìn)一步減少，而且細(xì)胞偽足變得更加纖細(xì)并排列更加稀疏．轉(zhuǎn)染72h后，干擾組細(xì)胞（圖2，J）與錯義對照組細(xì)胞（圖2，E）相比邊界變得更加模糊，且細(xì)胞開始變形，細(xì)胞表面微絨毛大量消失，而且偽足明顯變少并多數(shù)斷裂變短，且方向性差．轉(zhuǎn)染96h后，干擾組細(xì)胞（圖2，K）與錯義對照組細(xì)胞（圖2，F(xiàn)）相比，其外形變?yōu)榻咏鼒A形的不規(guī)則形狀，細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞表面微絨毛幾乎全部消失，使細(xì)胞表面趨于光滑，僅有少數(shù)的偽足存在，且偽足長短、粗細(xì)不均，分布雜亂．轉(zhuǎn)染120h后，干擾組細(xì)胞（圖2，L）與錯義對照組細(xì)胞（圖2，G）相比，體積進(jìn)一步縮小，細(xì)胞表面微絨毛及偽足結(jié)構(gòu)均近乎完全消失，另外可見部分細(xì)胞膜區(qū)域出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象．

3 討論

ANXA2作為一種多功能的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，參與許多生命活動：調(diào)節(jié)Ca2＋依賴的膜性生物學(xué)活動［5］；穩(wěn)定細(xì)胞骨架［6］；促進(jìn)DNA合成及腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［7］；并在血管生成過程中起重要作用［8］．大量研究表明，ANXA2在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，我們前期研究已證明以ANXA2為靶基因設(shè)計合成的干擾重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2可在mRNA及蛋白水平顯著下調(diào)ANXA2在Caco2細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而抑制Caco2細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］．在此基礎(chǔ)上，將干擾重組質(zhì)粒pU6H1－GFP－siANXA2導(dǎo)入Caco2細(xì)胞后，以掃描電鏡觀察了ANXA2表達(dá)對Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面超微結(jié)構(gòu)影響．環(huán)境掃描電鏡觀察顯示，Caco2細(xì)胞內(nèi)ANXA2表達(dá)被抑制后，細(xì)胞由伸展性良好的六邊形或多角形逐漸收縮變小，成為圓形或不規(guī)則形狀；細(xì)胞表面微絨毛及偽足等結(jié)構(gòu)的形成受到明顯抑制，并隨時間延長而加劇，最終Caco2細(xì)胞表面原本十分發(fā)達(dá)的、與細(xì)胞活躍的運動力相關(guān)的結(jié)構(gòu)幾乎全部消失，細(xì)胞表面趨于光滑．腫瘤細(xì)胞表面大量微絨毛的存在可擴(kuò)張細(xì)胞表面積，增強(qiáng)細(xì)胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換及信息交流；同時大量微絨毛存在可使細(xì)胞表面粘液不至流失，保持細(xì)胞表面滑潤，減少細(xì)胞所受磨擦及由此造成的細(xì)胞損傷［10］．Caco2細(xì)胞表面微絨毛的減少勢必會削弱細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的相互作用，使得一些信息在細(xì)胞與環(huán)境間傳遞錯誤或中斷；微絨毛減少也將導(dǎo)致細(xì)胞的防御能力下降，從而影響細(xì)胞的正常生命活動，同時，微絨毛也是細(xì)胞自身的運動器官之一，故微絨毛的減少也勢必抑制細(xì)胞的運動力．發(fā)達(dá)的偽足結(jié)構(gòu)是腫瘤細(xì)胞活躍的運動力和侵襲力的最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和有別于正常細(xì)胞的明顯特征．偽足對腫瘤細(xì)胞運動、侵襲、黏附、攝取營養(yǎng)、支持等過程起關(guān)鍵作用，而且對腫瘤細(xì)胞突破血管壁的基底膜至關(guān)重要［11］，故而是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這種結(jié)構(gòu)受損，必然會使細(xì)胞的侵襲、運動、轉(zhuǎn)移能力減弱．

ANXA2的C端結(jié)構(gòu)域含有絲狀肌動蛋白（F－actin）結(jié)合位點，其在調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架重排、維持肌動蛋白骨架可塑性等活動中起重要作用［6］．Caco2細(xì)胞ANXA2表達(dá)被抑制后，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Rho蛋白活性降低［12－13］，抑制Rho／ROCK／LIMK／Cofilin通路活化肌動蛋白結(jié)合蛋白Cofilin［14］，從而可能導(dǎo)致與F－actin結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白Fascin表達(dá)水平降低［15］．也可能導(dǎo)致AHNAK－ANXA22／p112－F－actin［16］、Src－ANXA22／p112－F－actin［17］、CEACAM1－ANXA22／p112－F－actin［18］、CD44－ANXA22／p112－F－actin［19］等與F－actin活動緊密相關(guān)的復(fù)合體形成受阻．通過以上途徑，下調(diào)ANXA2的表達(dá)可能將干擾細(xì)胞內(nèi)F－actin的解聚、重排等正常活動，從而影響細(xì)胞表面以F－actin為主要組分的偽足及微絨毛等突起結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化．同時，ANXA2表達(dá)被抑制后，還可能通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)改變影響細(xì)胞質(zhì)膜的活性及動力學(xué)特性［5］，使細(xì)胞收縮變形、黏附性下降．此外，隨轉(zhuǎn)染后時間的延長，部分細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)褶皺或不完整狀態(tài)，顯示細(xì)胞凋亡現(xiàn)象．這是由于抑制ANXA2表達(dá)可能影響一些凋亡相關(guān)因子（如：前胃泌素、p53等）活性，進(jìn)而觸發(fā)一系列信號反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路［7，20］的啟動，從而使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡表型．

4 結(jié)論

本實驗以RNAi技術(shù)抑制ANXA2表達(dá)后，Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化．主要表現(xiàn)為細(xì)胞縮小變形；細(xì)胞表面微絨毛及偽足等突起結(jié)構(gòu)受損，逐漸減少甚至消失；最終一些細(xì)胞出現(xiàn)膜褶皺、不完整等凋亡表型．說明ANXA2表達(dá)與Caco2細(xì)胞表面形態(tài)變化密切相關(guān)，ANXA2在此過程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究．此研究為進(jìn)一步探索ANXA2在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中的作用以及結(jié)直腸癌基因治療提供細(xì)胞形態(tài)方面的依據(jù)．

［1］李鵬鴿，楊艷麗，葛玉婷，等．膜聯(lián)蛋白A2在腫瘤生長調(diào)節(jié)與細(xì)胞骨架活動中的作用［J］．生理科學(xué)進(jìn)展，2010，41（6）：457－460．

［2］Lokman N A，Ween M P，Oehler M K，et al．The role of annexin A2in tumorigenesis and cancer progression［J］．Cancer Microenvironment，2011，4：199－208．

［3］Duncan R，Carpenter B，Main L C，et al．Characterisation and protein expression profiling of annexins in colorectal cancer［J］．British Journal of Cancer，2008，98：426－433．

［4］Shan Ge．RNA interference as a gene knockdown technique［J］．The International Journal of Biochemistry＆Cell Biology，2010，42：1243－1251．

［5］Babiychuk E B，Draeger A．Annexins in cell membrane dynamics：Ca2＋－regulated association of lipid microdomains［J］．The Journal of Cell Biology，2000，150（5）：1113－1123．

［6］Hayes M J，Shao D，Bailly M，et al．Regulation of actin dynamics by annexin 2［J］．The EMBO Journal，2006，25：1816－1826．

［7］宋魏，仇曉菲．AnnexinⅡ與腫瘤的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（6）：851－853．

［8］Sharma M，Ownbey R T，Sharma M C．Breast cancer cell surface annexinⅡinduces cell migration and neoangiogenesis via tPA dependent plasmin generation［J］．Experimental and Molecular Pathology，2010，88：278－286．

［9］章藹然，潘寧，侯穎春．ANXA2基因表達(dá)水平對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及運動的影響［J］．陜西師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，37（6）：71－76．

［10］李繼承，俞壽民．間皮細(xì)胞微絨毛的超微結(jié)構(gòu)和功能［J］．科技通報，1989，5（5）：44－48．

［11］周方正，伍鋼．細(xì)胞偽足與腫瘤轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展［J］．臨床腫瘤學(xué)雜志，2007，12（1）：77－79．

［12］Babbin B A，Parkos C A，Mandell K J，et al．Annexin 2 regulates intestinal epithelial cell spreading and wound closure through Rho－related signaling［J］．The American Journal of Pathology，2007，170（3）：951－966．

［13］Rescher U，Ludwig C，Konietzko V，et al．Tyrosine phosphorylation of annexin A2regulates Rho－mediated actin rearrangement and cell adhesion［J］．Journal of Cell Science，2008，121（13）：2177－2185．

［14］Graauw Md，Tijdens I，Smeets M B，et al．Annexin A2 phosphorylation mediates cell scattering and branching morphogenesis via cofilin activation［J］．Molecular and Cellular Biology，2008，28（3）：1029－1040．

［15］Hou Y，Yang L，Mou M，et al．Annexin A2regulates the levels of plasmin，S100A10and fascin in L5178Y Cells［J］．Cancer Investigation，2008，26（8）：809－815．

［16］Benaud C，Gentil B J，Assard N，et al．AHNAK interaction with the annexin 2／S100A10complex regulates cell membrane cytoarchitecture［J］．The Journal of Cell Biology，2004，164（1）：133－144．

［17］Hayes M J，Moss S E．Annexin 2has a dual role as regulator and effector of v－Src in cell transformation［J］．The Journal of Biological Chemistry，2009，284（15）：10202－10210．

［18］Kirshner J，Schumann D，Shively J E．CEACAM1，a cell－cell adhesion molecule，directly associates with annexinⅡin a three－dimensional model of mammary morphogenesis［J］．The Journal of Biological Chemistry，2003，278（50）：50338－50345．

［19］Oliferenko S，Paiha K，Harder T，et al．Analysis of CD44－containing lipid rafts：recruitment of annexinⅡand stabilization by the actin cytoskeleton［J］．The Journal of Cell Biology，1999，146（4）：843－854．

［20］Huang Y，Jin Y，Yan C H，et al．Involvement of annexin A2in p53induced apoptosis in lung cancer［J］．Molecular Cell Biochemistry，2008，309：117－123．