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        ANXA2表達(dá)對Caco2細(xì)胞形態(tài)影響的掃描電鏡觀察

        2013-10-29 09:33:28牟茂森孫夢瑤何慧敏王曉靜王綺軒胥謹(jǐn)慧胡妍妍侯穎春
        關(guān)鍵詞:微絨毛錯義質(zhì)粒

        謝 楠,牟茂森,孫夢瑤,于 翔,高 寧,何慧敏,王曉靜,王綺軒,胥謹(jǐn)慧,胡妍妍,侯穎春

        (陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 西安710062)

        膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexins超基因家族中的成員,人類的ANXA2結(jié)構(gòu)基因位于15q21~q22.ANXA2由339個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為36kDa,由33kDa的C端結(jié)構(gòu)域和3kDa的N端結(jié)構(gòu)域組成.ANXA2主要以單體和異四聚體(ANXA22/p112)形式存在于人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中[1].大量研究表明,ANXA2在多種類型的腫瘤中過表達(dá),其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附、侵潤、增殖、遷移、凋亡等活動中起重要作用[2].

        結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤,ANXA2在人結(jié)直腸癌組織高表達(dá),可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3].RNA干擾(RNAi)技術(shù)是研究基因功能的重要方法之一,在腫瘤基因治療方面也具有很大潛力.該技術(shù)通過靶mRNA序列特異雙鏈小RNA分子(19-25bp)介導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默,從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的強(qiáng)有力阻斷[4].本實驗以人結(jié)直腸癌細(xì)胞(Caco2)為研究對象,采用RNAi技術(shù)抑制Caco2細(xì)胞中的ANXA2基因表達(dá),研究ANXA2表達(dá)對Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面與細(xì)胞運動密切相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)的影響,以期為揭示ANXA2在結(jié)直腸癌時扮演的作用提供外觀形態(tài)學(xué)方面的資料,為以ANXA2為靶基因?qū)θ私Y(jié)直腸癌進(jìn)行基因治療積累實驗資料.

        1 材料與方法

        1.1 siRNA及其表達(dá)質(zhì)粒

        Caco2細(xì)胞株購自美國ATCC;表達(dá)ANXA2特異性siRNA的質(zhì)粒pU6H1-GFP-siANXA2及錯義siRNA對照質(zhì)粒pU6H1-GFP-siRNASCR由百奧生物技術(shù)有限公司(南通)構(gòu)建合成.

        siRNA序列由我們設(shè)計,ANXA2特異性siRNA序列:TGTGTGGTGGAGATGACTGA;

        錯義對照siRNA序列:GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC.

        1.2 實驗試劑及儀器

        Endo-free Plasmid Mini Kit II為Omega產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;青霉素、鏈霉素、慶大霉素及胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品;STranG轉(zhuǎn)染試劑購自南京探求生物技術(shù)公司;電鏡級戊二醛固定液為Sigma產(chǎn)品.

        DMIL LED倒置熒光顯微成像系統(tǒng):德國徠卡公司;Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡:荷蘭FEI公司;K850臨界點干燥儀:英國Emitech公司;E-1010離子濺射鍍膜儀:日本日立公司.

        1.3 方法

        1.3.1 質(zhì)粒制備 質(zhì)粒pU6H1-GFP-siANXA2及pU6H1-GFP-siRNASCR的制備參照Endo-free Plasmid Mini Kit II說明書進(jìn)行.

        1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Caco2細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、100μg/mL慶大霉素),于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng).將對數(shù)生長期細(xì)胞以1.5×105個/皿接種于含有無菌蓋玻片的30mm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁率達(dá)60%~70%時將質(zhì)粒pU6H1-GFP-siANXA2和pU6H1-GFP-siRNASCR分別以每皿4.5μg的用量導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)(S-TranG轉(zhuǎn)染試劑說明書).設(shè)野生對照組(未轉(zhuǎn)染的Caco2).每24h更換一次培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染60h后,用倒置熒光顯微鏡(激發(fā)光波長為488nm)檢測細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況以估算轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%.

        1.3.3 環(huán)境掃描電子顯微鏡制樣 分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120h在各組取出鋪有細(xì)胞的蓋玻片進(jìn)行掃描電鏡制樣:(1)用PBS洗3次,每次5 min;(2)2.5%電鏡級戊二醛4℃下固定60min;(3)預(yù)冷三蒸水洗3次,每次5min;(3)酒精逐級(30%,50%,75%,85%,95%,100%,100%)脫水,每級2min;(4)乙酸異戊酯置換乙醇;(5)臨界點干燥;(6)真空鍍金;(7)環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察,數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集.

        2 結(jié)果

        2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

        轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒60h后細(xì)胞GFP的表達(dá)如圖1所示.轉(zhuǎn)染效率>80%.

        圖1 轉(zhuǎn)染60h后Caco2細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)水平(×10)Fig.1 GFP expression in Caco2cells at 60hpost transfection

        2.2 環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察

        圖2Caco2細(xì)胞環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察Fig.2 ESEM images of Caco2cells

        環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示,野生對照組細(xì)胞整體形態(tài)豐滿,表現(xiàn)很好的貼壁狀態(tài),細(xì)胞多成六邊形或多角形;細(xì)胞表面富致密的微絨毛;幾乎每個細(xì)胞都有發(fā)達(dá)的多而長的偽足自細(xì)胞膜處伸出到無細(xì)胞區(qū),并與其它鄰近細(xì)胞伸出的偽足相互緊密嵌合或連接(圖2,A,B).錯義對照組細(xì)胞(即轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU6H1-GFP-siRNASCR的Caco2細(xì)胞)形態(tài)與野生對照組細(xì)胞基本一致,且隨時間延長到120h時細(xì)胞形態(tài)仍無明顯變化(圖2,C,D,E,F(xiàn),G).干擾組細(xì)胞(即轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU6H1-GFP-siANXA2的Caco2細(xì)胞)形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)變化,而且這種變化隨時間延長愈加明顯.轉(zhuǎn)染24h后,干擾組細(xì)胞(圖2,H)與錯義對照組細(xì)胞(圖2,C)相比整體形態(tài)無顯著變化,但細(xì)胞表面微絨毛及偽足結(jié)構(gòu)均略有減少.轉(zhuǎn)染48h后,干擾組細(xì)胞(圖2,I)形態(tài)與錯義對照組細(xì)胞(圖2,D)相比出現(xiàn)較明顯變化,邊界變模糊,細(xì)胞表面微絨毛進(jìn)一步減少,而且細(xì)胞偽足變得更加纖細(xì)并排列更加稀疏.轉(zhuǎn)染72h后,干擾組細(xì)胞(圖2,J)與錯義對照組細(xì)胞(圖2,E)相比邊界變得更加模糊,且細(xì)胞開始變形,細(xì)胞表面微絨毛大量消失,而且偽足明顯變少并多數(shù)斷裂變短,且方向性差.轉(zhuǎn)染96h后,干擾組細(xì)胞(圖2,K)與錯義對照組細(xì)胞(圖2,F(xiàn))相比,其外形變?yōu)榻咏鼒A形的不規(guī)則形狀,細(xì)胞體積明顯變小,細(xì)胞表面微絨毛幾乎全部消失,使細(xì)胞表面趨于光滑,僅有少數(shù)的偽足存在,且偽足長短、粗細(xì)不均,分布雜亂.轉(zhuǎn)染120h后,干擾組細(xì)胞(圖2,L)與錯義對照組細(xì)胞(圖2,G)相比,體積進(jìn)一步縮小,細(xì)胞表面微絨毛及偽足結(jié)構(gòu)均近乎完全消失,另外可見部分細(xì)胞膜區(qū)域出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象.

        3 討論

        ANXA2作為一種多功能的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白,參與許多生命活動:調(diào)節(jié)Ca2+依賴的膜性生物學(xué)活動[5];穩(wěn)定細(xì)胞骨架[6];促進(jìn)DNA合成及腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7];并在血管生成過程中起重要作用[8].大量研究表明,ANXA2在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào),并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一,我們前期研究已證明以ANXA2為靶基因設(shè)計合成的干擾重組質(zhì)粒pU6H1-GFP-siANXA2可在mRNA及蛋白水平顯著下調(diào)ANXA2在Caco2細(xì)胞中的表達(dá),進(jìn)而抑制Caco2細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9].在此基礎(chǔ)上,將干擾重組質(zhì)粒pU6H1-GFP-siANXA2導(dǎo)入Caco2細(xì)胞后,以掃描電鏡觀察了ANXA2表達(dá)對Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面超微結(jié)構(gòu)影響.環(huán)境掃描電鏡觀察顯示,Caco2細(xì)胞內(nèi)ANXA2表達(dá)被抑制后,細(xì)胞由伸展性良好的六邊形或多角形逐漸收縮變小,成為圓形或不規(guī)則形狀;細(xì)胞表面微絨毛及偽足等結(jié)構(gòu)的形成受到明顯抑制,并隨時間延長而加劇,最終Caco2細(xì)胞表面原本十分發(fā)達(dá)的、與細(xì)胞活躍的運動力相關(guān)的結(jié)構(gòu)幾乎全部消失,細(xì)胞表面趨于光滑.腫瘤細(xì)胞表面大量微絨毛的存在可擴(kuò)張細(xì)胞表面積,增強(qiáng)細(xì)胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換及信息交流;同時大量微絨毛存在可使細(xì)胞表面粘液不至流失,保持細(xì)胞表面滑潤,減少細(xì)胞所受磨擦及由此造成的細(xì)胞損傷[10].Caco2細(xì)胞表面微絨毛的減少勢必會削弱細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的相互作用,使得一些信息在細(xì)胞與環(huán)境間傳遞錯誤或中斷;微絨毛減少也將導(dǎo)致細(xì)胞的防御能力下降,從而影響細(xì)胞的正常生命活動,同時,微絨毛也是細(xì)胞自身的運動器官之一,故微絨毛的減少也勢必抑制細(xì)胞的運動力.發(fā)達(dá)的偽足結(jié)構(gòu)是腫瘤細(xì)胞活躍的運動力和侵襲力的最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和有別于正常細(xì)胞的明顯特征.偽足對腫瘤細(xì)胞運動、侵襲、黏附、攝取營養(yǎng)、支持等過程起關(guān)鍵作用,而且對腫瘤細(xì)胞突破血管壁的基底膜至關(guān)重要[11],故而是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),這種結(jié)構(gòu)受損,必然會使細(xì)胞的侵襲、運動、轉(zhuǎn)移能力減弱.

        ANXA2的C端結(jié)構(gòu)域含有絲狀肌動蛋白(F-actin)結(jié)合位點,其在調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架重排、維持肌動蛋白骨架可塑性等活動中起重要作用[6].Caco2細(xì)胞ANXA2表達(dá)被抑制后,可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Rho蛋白活性降低[12-13],抑制Rho/ROCK/LIMK/Cofilin通路活化肌動蛋白結(jié)合蛋白Cofilin[14],從而可能導(dǎo)致與F-actin結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白Fascin表達(dá)水平降低[15].也可能導(dǎo)致AHNAK-ANXA22/p112-F-actin[16]、Src-ANXA22/p112-F-actin[17]、CEACAM1-ANXA22/p112-F-actin[18]、CD44-ANXA22/p112-F-actin[19]等與F-actin活動緊密相關(guān)的復(fù)合體形成受阻.通過以上途徑,下調(diào)ANXA2的表達(dá)可能將干擾細(xì)胞內(nèi)F-actin的解聚、重排等正常活動,從而影響細(xì)胞表面以F-actin為主要組分的偽足及微絨毛等突起結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化.同時,ANXA2表達(dá)被抑制后,還可能通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)改變影響細(xì)胞質(zhì)膜的活性及動力學(xué)特性[5],使細(xì)胞收縮變形、黏附性下降.此外,隨轉(zhuǎn)染后時間的延長,部分細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)褶皺或不完整狀態(tài),顯示細(xì)胞凋亡現(xiàn)象.這是由于抑制ANXA2表達(dá)可能影響一些凋亡相關(guān)因子(如:前胃泌素、p53等)活性,進(jìn)而觸發(fā)一系列信號反應(yīng),誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路[7,20]的啟動,從而使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡表型.

        4 結(jié)論

        本實驗以RNAi技術(shù)抑制ANXA2表達(dá)后,Caco2細(xì)胞形態(tài)及表面超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化.主要表現(xiàn)為細(xì)胞縮小變形;細(xì)胞表面微絨毛及偽足等突起結(jié)構(gòu)受損,逐漸減少甚至消失;最終一些細(xì)胞出現(xiàn)膜褶皺、不完整等凋亡表型.說明ANXA2表達(dá)與Caco2細(xì)胞表面形態(tài)變化密切相關(guān),ANXA2在此過程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究.此研究為進(jìn)一步探索ANXA2在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中的作用以及結(jié)直腸癌基因治療提供細(xì)胞形態(tài)方面的依據(jù).

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