張 坤，崔連新，康 玲，2，王筱冰＊，劉全宏

（1陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062；2新疆醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011）

食管癌（Esophageal Cancer，EC）是由食管黏膜上皮或腺體發(fā)生惡性增殖導(dǎo)致的腫瘤，是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一．在我國(guó)，食管癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第二位［1］．目前，食管癌發(fā)生的早期診斷還很困難，其發(fā)現(xiàn)多為中晚期，而食管癌的早期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是造成人死亡的重要原因．食管癌目前的主要治療手段仍然是傳統(tǒng)的放療、化療及手術(shù)療法，但體質(zhì)虛弱的臨床患者，常不能耐受手術(shù)和放化療．而且，食管是人進(jìn)食的必需管道，其癌變的發(fā)生使得患者進(jìn)食困難，生活質(zhì)量下降，最終影響其生存狀況．

腫瘤光動(dòng)力療法（Photodynamic Therapy，PDT）是近30年興起并不斷發(fā)展的腫瘤治療技術(shù)，其原理主要是利用光敏劑能特異性選擇聚集在腫瘤組織內(nèi)，經(jīng)特定波長(zhǎng)的光照激發(fā)，產(chǎn)生單線態(tài)氧等自由基對(duì)腫瘤組織進(jìn)行殺傷．PDT具有對(duì)腫瘤組織選擇性和特異性高、對(duì)正常組織毒性低等優(yōu)點(diǎn)，且其可與傳統(tǒng)治療手段同時(shí)應(yīng)用．在PDT過程中，光敏劑的選擇起到至關(guān)重要的作用．目前PDT臨床治療中，應(yīng)用最多的主要是以血卟啉及其衍生物（Hematoporphyrin Derivative，HpD）為代表的第一代光敏劑．已有研究表明，光動(dòng)力療法在治療Barrett食管（BE）及早期食管癌方面已經(jīng)取得較好療效［2－4］．但由于血卟啉及其衍生物有成分不清楚、代謝周期慢、毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)，影響腫瘤的治療效果．因此，尋找和開發(fā)成分單一穩(wěn)定、對(duì)腫瘤選擇性高的第二代光敏劑是光動(dòng)力治療腫瘤領(lǐng)域一個(gè)重要問題．二氫卟吩e6（Chlorin e6，Ce6）是一種單體四吡咯化合物，屬于葉綠素類光敏劑，其經(jīng)光照射后的單線態(tài)氧產(chǎn)率高，且具有對(duì)腫瘤選擇性強(qiáng)、體內(nèi)清除速度快、毒副作用小等特點(diǎn)．已有研究發(fā)現(xiàn)，激光結(jié)合二氫卟吩e6對(duì)黑色素瘤可以產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)［5］，但有關(guān)Ce6－PDT在食管癌治療方面的報(bào)道尚少．

本實(shí)驗(yàn)主要研究二氫卟吩e6介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca—109的影響，通過四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ce6－PDT對(duì)Eca—109細(xì)胞的增殖及細(xì)胞遷移的影響，初步探討光敏劑二氫卟吩e6對(duì)體外食管癌細(xì)胞光動(dòng)力殺傷效應(yīng)，以期為光敏劑治療食管癌提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自Gibco公司，胰蛋白酶，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二氫卟吩e6購(gòu)自美國(guó)Frontiersci公司．

1．1．2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）、熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、Exl800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）、高速冷凍平板離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、半導(dǎo)體激光儀（西北大學(xué)光電子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）．

1．1．3 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞株Eca—109購(gòu)自南京凱基生物有限責(zé)任公司，在含15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37攝氏度5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期．

1．2 方法

實(shí)驗(yàn)前調(diào)整細(xì)胞密度為1×104cells／mL，接種于96孔板，每孔200μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)后每孔加入5mg／mL的3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心，吸棄上清，每孔加100μL二甲基亞砜，震蕩15min，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定各孔吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值×100%．實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．

1．2．1 不同濃度Ce6對(duì)食管癌Eca—109細(xì)胞增殖的影響 方法同上，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不加Ce6，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度Ce6，使Ce6終濃度分別為0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL，加入Ce6后每組分別孵育1h、2h、4h、8h、12h和24h，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率．

1．2．2 光照結(jié)合不同濃度Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的影響 方法同上，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、單純光照組和光照結(jié)合不同濃度Ce6組，對(duì)照組不經(jīng)任何處理，單純光照組用5J／cm2光照處理，光照結(jié)合不同濃度Ce6組在加入Ce6后（Ce6終濃度分別為0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL）每組分別孵育1、2、4、8、12和24h，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，并用5J／cm2的光照處理，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率．

1．2．3 光照結(jié)合不同濃度Ce6處理后不同時(shí)間對(duì)Eca—109增殖的影響 方法同上，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不經(jīng)任何處理，實(shí)驗(yàn)組Ce6終濃度分別為0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL，分別孵育12h，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，并用5J／cm2的光照處理，處理后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2、4、8、12和24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率．

1．2．4 不同光照劑量結(jié)合Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的影響 方法同上，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不經(jīng)任何處理，實(shí)驗(yàn)組Ce6終濃度分別為0．125、0．25、0．5和1．0μg／mL，分別孵育12h，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，分別用2．5，5，7．5，10和12．5J／cm2的光照處理，處理后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率．

1．2．5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光照結(jié)合Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞遷移能力的影響 調(diào)整細(xì)胞濃度為3．2×104cells／mL，接種于96孔板，每孔200μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入Ce6，使其終濃度分別為0．125、0．25和0．5ug／mL，繼續(xù)孵育12h后吸去培養(yǎng)基，用無(wú)菌的10μL槍頭劃痕損傷后，PBS沖洗3次，采用5J／cm2光照處理，加入200μL無(wú)血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后拍照．對(duì)照組不做光照處理，實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次．

1．3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，采用SPSS 16．0軟件（SPSS Inc．，Chicago，USA）進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s．E．M表示，并采用單因素方差（ANOVA）分析及Student’s t－檢驗(yàn)分析顯著性差異．

2 結(jié)果

2．1 不同濃度Ce6對(duì)食管癌Eca—109細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，不同Ce6濃度組（0．125、0．25和0．5μg／mL）在孵育不同時(shí)間（1、2、4、8、12、24h）與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），而Ce6濃度為1．0μg／mL時(shí)，孵育至4、12h和24 h時(shí)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），說(shuō)明低濃度的Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞的增殖無(wú)影響，高濃度的Ce6對(duì)細(xì)胞的增殖有抑制作用．

圖1 Ce6作用后食管癌細(xì)胞Eca—109的存活率Fig．1 The concentration effect of chlorin e6 on cell survival rate of Eca—109

2．2 光照結(jié)合不同濃度Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，單純光照組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；孵育4h后，0．125 μg／mL Ce6聯(lián)合光照組與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0．05），較高濃度的Ce6（0．25μg／mL、0．5 μg／mL和1．0μg／mL）聯(lián)合光照處理后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯（P＜0．01）；孵育8h后，不同Ce6組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；說(shuō)明單純光對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響，Ce6－PDT能抑制Eca—109細(xì)胞的增殖，并且隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞的生存率降低，Ce6－PDT對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，在共同孵育12h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最大，到達(dá)平臺(tái)期．

當(dāng)給予5J／cm2的光照處理與無(wú)光組比較，光照條件下Eca—109細(xì)胞的存活率明顯低于無(wú)光照組，如當(dāng)Ce6終濃度為0．5μg／mL，與細(xì)胞孵育12h，無(wú)光條件下Eca—109細(xì)胞的存活率是96．71%，而Ce6－PDT后Eca—109細(xì)胞的存活率為57．44%，Ce6－PDT能有效的抑制Eca—109的增殖．

圖2 孵育時(shí)間對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的影響Fig．2 Effects of incubation time on cell proliferation of Eca—109

2．3 光照結(jié)合不同濃度Ce6處理后不同時(shí)間對(duì)Eca—109增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，0．125μg／mL Ce6－PDT對(duì)細(xì)胞的增殖影響較小，在作用后的4h起表現(xiàn)出明顯的抑制作用（與對(duì)照組相比，P＜0．05），而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用沒有明顯的變化；0．25μg／mL Ce6－PDT同樣是在作用后4h起對(duì)細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用（與對(duì)照組相比，P＜0．05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制的作用增強(qiáng)（與對(duì)照組相比，P＜0．01）；較高濃度的Ce6（0．5μg／mL和1．0μg／mL）在PDT作用后的2h時(shí)的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0．05），并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（4、8、12h及24h）表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性（與對(duì)照組相比，P＜0．01）．說(shuō)明在一定的Ce6濃度下，隨著處理后作用時(shí)間的增加，Eca—109細(xì)胞的相對(duì)存活率降低，Ce6－PDT對(duì)Eca—109增殖的抑制作用增強(qiáng)，具有作用時(shí)間依賴性．

圖3 作用時(shí)間對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的影響Fig．3 Effects of interaction time on cell proliferation of Eca—109

2．4 不同光照劑量結(jié)合Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，較低的光照劑量（2．5J／cm2）聯(lián)合較低劑量的Ce6（0．125μg／mL和0．25 μg／mL）對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用不顯著（P＞0．05），而與較高濃度的Ce6（0．5μg／mL和1．0μg／mL）聯(lián)合作用時(shí)則表現(xiàn)出較為明顯的抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)（P＜0．05）；較高的光照劑量組（5、7．5、10和12．5 J／cm2）與無(wú)光組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），Ce6－PDT對(duì)Eca—109的增殖的抑制作用具有光照劑量依賴性，光照劑量為10和12．5J／cm2都能明顯的抑制細(xì)胞的增殖，但是抑制作用相差不大，達(dá)到平臺(tái)期．

圖4 光照劑量對(duì)Eca—109增殖的影響Fig．4 Effects of irradiation doses on cell proliferation of Eca—109

2．5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光照結(jié)合Ce6對(duì)Eca—109細(xì)胞遷移能力影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，正常對(duì)照組和單純光照組細(xì)胞劃痕寬帶較?。▓D5A，5E）；單純Ce6組，隨著Ce6濃度增加，劃痕的寬度在逐漸增加（圖5B、C、D），當(dāng)Ce6濃度為0．5μg／mL時(shí)劃痕寬度最大，細(xì)胞幾乎沒有遷移到劃痕處（圖5D）；光照結(jié)合0．125μg／mLCe6處理后（圖5F），與對(duì)照組相比，劃痕寬度較大，但當(dāng)Ce6濃度增大到0．25和0．5μg／mL時(shí)（圖5G、H），與對(duì)照組和單純光照組相比，劃痕寬度差異明顯，與單純Ce6處理組相比，劃痕寬度變化并不明顯．

圖5 不同濃度的Ce6－PDT對(duì)Eca—109細(xì)胞遷移的影響Fig．5 Effect of Ce6－PDT with different concentration on cells migration of Eca—109

3 討論

從MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在Eca—109細(xì)胞水平上單純的光照對(duì)細(xì)胞的增殖沒有影響，低濃度的Ce6（低于0．5μg／mL）對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯作用，但當(dāng)Ce6增大到1．0μg／mL，表現(xiàn)出對(duì)Eca—109細(xì)胞增殖的抑制．龍朝欽［5］等通過Ce6－PDT對(duì)黑素瘤A—375細(xì)胞研究得出Ce6－PDT能有效的殺傷體外培養(yǎng)的人黑素瘤A—375細(xì)胞，得出的結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)一致，對(duì)于原因其認(rèn)為可能是Ce6在腫瘤選擇性方面存在局限與其治療劑量對(duì)正常細(xì)胞的毒性有關(guān)．但Sheleg等用Ce6－PDT應(yīng)用于臨床治療惡性黑色素瘤取得了良好的效果，并未發(fā)現(xiàn)明顯的Ce6的系統(tǒng)毒性［6］．對(duì)于兩者報(bào)道的差異，仍需要深入研究，相關(guān)研究也報(bào)道了Ce6對(duì)腫瘤的治療中優(yōu)越性［7－8］．Ce6－PDT能有效抑制Eca—109細(xì)胞的增殖，存在Ce6濃度、孵育時(shí)間、作用時(shí)間和光照劑量的依賴性，并且在一定程度內(nèi)，其抑制作用隨著Ce6濃度、光照劑量和孵育時(shí)間的增加增強(qiáng)，但對(duì)增殖的抑制作用均存在平臺(tái)期，并不是光敏劑用量越多、光照劑量越高、孵育時(shí)間和作用時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效果越明顯，如光照劑量為10J／cm2和12．5J／cm2都能明顯的抑制細(xì)胞的增殖，但是抑制作用相比差異不顯著，原因可能是細(xì)胞對(duì)光敏劑的吸收代謝及過高光照劑量導(dǎo)致缺氧限制了PDT的效果［9－10］．提示在Ce6－PDT治療過程中，合適的PDT參數(shù)對(duì)治療的重要性．

浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是腫瘤最基本的生物學(xué)特征，也是引起腫瘤患者死亡的主要原因之一，腫瘤的定向遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，在通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ce6－PDT對(duì)細(xì)胞遷移能力影響的研究中，低濃度Ce6（低于0．125μg／mL）光動(dòng)力對(duì)細(xì)胞的遷移作用明顯；但Ce6濃度繼續(xù)增大到0．5μg／mL，Ce6－PDT組與單純Ce6組劃痕寬度比較差異不明顯，Ce6－PDT對(duì)Eca—109細(xì)胞遷移無(wú)明顯作用．目前關(guān)于對(duì)食管癌遷移機(jī)制的報(bào)道比較多，如Verma等［11］分析食管癌中活化白細(xì)胞黏附分子（Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule，ALCAM）的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)85%食管癌和67%不典型增生中ALCAM高表達(dá)，與食管癌的轉(zhuǎn)移高度相關(guān)．在食管癌的遷移過程中Ezdin骨架蛋白、特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA ethyltransferase，DNMT）、CD97、JWA基因和Snail基因等諸多因素都被報(bào)道與之相關(guān)［12－16］．但對(duì)于Ce6如何影響Eca—109細(xì)胞遷移，目前還不清楚．

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，光照結(jié)合二氫卟吩e6可以對(duì)食管癌Eca—109細(xì)胞產(chǎn)生一定的細(xì)胞增值抑制，并且對(duì)其遷移能力也有一定的影響，但關(guān)于Ce6－PDT對(duì)食管癌的增殖和遷移的具體機(jī)制還不是十分清楚，仍需進(jìn)一步研究．

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