田文莉 ，邵銘 ，祁驥 ，劉淑珍 ，谷堃 ，李長(zhǎng)貴 ，楊旭 ，李小強(qiáng)

1.天士力金納生物技術(shù)（天津）有限公司，天津 300410；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

流感病毒表面散布著幾種形態(tài)不一的蛋白突起，其中含量最多的是血凝素（haemagglutinin，HA），它是流感病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白[1]，也是流感病毒亞單位疫苗中有效的免疫原性物質(zhì)[2-4]。在組成流感病毒的所有蛋白質(zhì)中，HA約占總蛋白量的30%，核蛋白（nucleocapside protein，NP）次之，占總蛋白量的25%左右。基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）包括M1和M2，M1是病毒粒子中最豐富的一種多肽。HA分子由重鏈（HA1）和輕鏈（HA2）組成，由一個(gè)精氨酸（Arg）殘基相連，同時(shí)具有若干個(gè)糖基化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)的數(shù)目和位置隨毒株不同而異[5-7]。

肽N-糖苷酶F（PNGase F）是一種酰氨酶，可以在N-糖蛋白的高甘露糖、雜合和復(fù)合寡糖部分最內(nèi)側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基之間進(jìn)行切割，幾乎可以水解糖肽/糖蛋白中所有N-聚糖鏈[8-9]。

由于糖蛋白在還原型SDS-PAGE中的遷移率不同于無(wú)糖基化的蛋白質(zhì)[10]，因此我們擬采用PNGase F對(duì)不同型別的流感病毒亞單位疫苗中間體進(jìn)行了去糖基化處理，消除了血凝素亞基糖基化對(duì)電泳遷移率的影響，使樣品中不同組分的蛋白質(zhì)得到了更好的分離，從而提高了對(duì)雜質(zhì)的分辨力。

1 材料與方法

1.1 材料

流感病毒亞單位疫苗超離中間體（ultracen?tri-fugation intermediate）為疫苗生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)蔗糖密度梯度離心分離得到的產(chǎn)物，主要成分為HA，由天士力金納生物技術(shù)（天津）有限公司生產(chǎn)。H1N1亞型流感病毒毒株為NYMC X-181 reassortant de?rived from A/California/7/2009，H3N2亞型毒株為IVR-155 reassortantderived from A/Victoria/210/2009。

本研究以疫苗生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)蔗糖密度梯度離心分離的雜質(zhì)峰（簡(jiǎn)稱超離雜峰，ultracentrifugation impurity peak）為對(duì)照樣品，由天士力金納生物技術(shù)（天津）有限公司生產(chǎn)技術(shù)部提供。該樣品除含有少量HA外，還含有流感病毒顆粒中的其他蛋白質(zhì)成分，其毒株來(lái)源與對(duì)應(yīng)的疫苗中間體樣品相同。

PNGase F購(gòu)自New England Biolabs（500 000 U/mL）；糖苷酶貯存液［50 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5 mmol/L Na2EDTA，50% 甘油］；SDS-PAGE用試劑購(gòu)自Sigma公司；SDS-PAGE低分子量蛋白質(zhì)marker由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所監(jiān)制；染色液（0.25%考馬斯亮藍(lán)R250溶于脫色液中）；脫色液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸∶水=9∶9∶2）。

1.2 去糖基化處理

將樣品稀釋至總蛋白濃度約為1000 μg/mL，參照文獻(xiàn)[11-12]所述方法取稀釋后的樣品36 μL，加入10×Glycoprotein Denaturing Buffer 4 μL，混勻后100℃水浴10 min，使蛋白質(zhì)變性；冷卻至室溫后分別加入 10×G7 Reaction Buffer 5 μL、10%NP-40 5 μL及50 000 U/mL的PNGase F（以糖苷酶貯存液進(jìn)行1/10稀釋）1 μL，混勻后37℃水浴過(guò)夜（約16 h）。

1.3 SDS-PAGE

分別取36 μL未經(jīng)處理樣品加入15 μL PBS（使其與處理后的蛋白濃度一致），作為去糖基化處理前的對(duì)照。向去糖基化處理前和處理后的樣品管中分別加入6×還原型上樣緩沖液10 μL，混勻后100℃水浴5 min，冷卻至室溫后上樣。

圖1 H1N1亞型樣品去糖基化處理前、后的SDS-PAGE

采用Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，聚丙烯酰胺電泳凝膠（丙烯酰胺單體與N，N'-甲叉雙丙烯酰胺單體的比例為37.5∶1），濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。每孔上樣15 μL，濃縮膠60 V、分離膠120 V，恒壓電泳，待染料遷移至凝膠邊緣時(shí)終止電泳，取出凝膠進(jìn)行固定、染色、脫色、成像。

2 結(jié)果

2.1 H1N1亞型中間體雜質(zhì)分析

取H1N1亞型超離中間體和超離雜峰去糖基化處理前、后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖1。由泳道1、2條帶可以看出，糖基化的HA1與NP的電泳條帶重合，去糖基化處理后可以清楚地區(qū)分這2個(gè)蛋白；HA2在去糖基化后也能觀察到其電泳遷移率的改變。由泳道3、4可以看出，H1N1亞型超離中間體樣品去糖基化后仍然只能觀察到HA1和HA2蛋白條帶，說(shuō)明該樣品的血凝素純度很高，幾乎不含其他蛋白。

其中，第2泳道的超離雜峰樣品在去糖基化處理時(shí)加入的是未經(jīng)稀釋的糖苷酶，圖中可見相對(duì)分子質(zhì)量為36×103的糖苷酶條帶；而第4泳道的超離中間體樣品則使用稀釋后的糖苷酶，其含量低于考馬斯亮藍(lán)染色的檢測(cè)限。

2.2 H3N2亞型中間體雜質(zhì)分析

取H3N2亞型超離中間體和超離雜峰去糖基化處理前、后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，經(jīng)去糖基化處理后，HA1和HA2的遷移率均有明顯改變。第1泳道超離雜峰樣品未經(jīng)去糖基化處理前M蛋白與HA2的電泳條帶緊密相鄰難以分辨，經(jīng)去糖基化處理后2種蛋白即可被清楚地區(qū)分。此外，泳道4超離中間體樣品去糖基化后仍然只能觀察到清晰的HA1和HA2條帶，說(shuō)明該樣品血凝素純度很高。

圖2 H3N2亞型樣品去糖基化處理前、后的SDS-PAGE

3 討論

流感病毒亞單位疫苗的生產(chǎn)，首先是用各型別的毒種分別接種雞胚以制備大量的流感病毒；然后將病毒裂解，通過(guò)蔗糖密度梯度超速離心獲得以各型別HA為主要成分的超離中間體，再經(jīng)柱純化后得到各型別的單價(jià)原液；最后將規(guī)定型別、經(jīng)檢驗(yàn)合格的單價(jià)原液按照一定的HA濃度混合制得流感病毒亞單位疫苗[13]。其中，蔗糖密度梯度離心是HA和其他雜質(zhì)蛋白的分離中最直接、最關(guān)鍵的步驟，因此超離中間體中HA的含量及純度就直接關(guān)系著流感病毒亞單位疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣。

在本研究中，我們以生產(chǎn)過(guò)程中分離到的雜質(zhì)樣品作為對(duì)照，研究和分析了不同型別流感病毒亞單位疫苗的中間產(chǎn)品，針對(duì)血凝素是糖蛋白的特性對(duì)其進(jìn)行去糖基化處理，然后再以還原型SDS-PAGE來(lái)分析，顯著提高了純度分析的分辨力。

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