郝春秋，彭梅娟，謝玉梅，周云，魏欣，馬力，王素娜，李瑞娟，張巖，白雪帆，賈戰(zhàn)生

第四軍醫(yī)大學 唐都醫(yī)院感染病診療中心，陜西 西安 710038

腺病毒具有宿主范圍廣、感染率高、包裝容量大、繁殖滴度高、安全性好、性質穩(wěn)定、載體制備較容易等特點[1]，已成為應用最廣泛的載體系統(tǒng)之一。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是重要的促組織纖維化蛋白，與肝、肺、腎等許多器官的纖維化密切相關[2]，是促進膠原沉積致肝纖維化的主要細胞因子。RNA干擾（RNA interfer?ence，RNAi）可以在轉錄后水平阻斷基因表達，使靶基因沉默，是研究特定基因功能的可靠技術[3]。我們試圖利用RNAi原理，構建能介導CTGF基因沉默的復制缺陷型腺病毒載體，為肝纖維化的防治提供一個有用的工具。

1 材料和方法

1.1 材料

腺病毒載體系統(tǒng)（穿梭質粒pShuttle-H1、骨架質粒pAdEasy-1及包裝細胞AD-293）由德國學者Reske教授惠贈；大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自ATCC；大腸桿菌BJ-5183和DH5α由本實驗室保存。

限制性內切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR產物回收試劑盒及Plasmid Purifica?tion Kit均為Promega公司產品；脂質體Lipo?fectAMINE2000、DMEM、RPMI1640及胎牛血清均為Gibco公司產品；抗CTGF單克隆抗體、抗β-actin抗體購自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 靶向CTGF短發(fā)夾RNA的設計

根據(jù)小干擾 RNA（siRNA）設計原則[4-5]，參考GenBank公布的大鼠 CTGF（NM-022266）核苷酸序列，利用Ambion公司在線（http://www.ambion.com）設計工具，設計4對針對CTGF基因的siRNA序列（TS1～TS4）和1對無關陰性對照序列（TS5），并進行BLAST同源性分析，保證序列的惟一性。為方便克隆與鑒定，在其5'和3'端分別引入BglⅡ和HindⅢ酶切位點，反義片段以后接終止信號TTTTTT以終止轉錄，形成BglⅡ酶切位點+19nt正義靶序列+9nt loop接頭序列+19nt反義靶序列+終止信號+HindⅢ酶切位點的結構（寡核苷酸由上海吉凱基因技術有限公司合成）。見表1。

1.3 腺病毒穿梭質粒p-shuttle-CTGF的構建及鑒定

將合成的單鏈寡核苷酸退火形成雙鏈DNA并檢測無誤。用HindⅢ、BglⅡ雙酶切穿梭質粒pShut?tle-H1（圖1），酶切產物純化后，用T4噬菌體DNA連接酶于16℃連接線性化的pShuttle-H1及退火后的雙鏈DNA 12 h，轉化DH5α感受態(tài)細菌，在卡那霉素抗性LB平板上于37℃培養(yǎng)過夜，篩選擴增轉化的陽性菌落，提取質粒并純化后獲得腺病毒穿梭質粒p-shuttle-CTGF，用EcoRⅠ酶切鑒定，并將酶切后獲得的小片段回收進行測序分析。

1.4 復制缺陷型腺病毒載體Ad.H1-CTGF的包裝和滴定

培養(yǎng)腺病毒包裝細胞AD-293，達80%～90%匯合時加入1 μg鑒定無誤的腺病毒穿梭質粒p-shut?tle-CTGF 與 4 μg 骨 架 質 粒 pAdEasy-1，用 Lipo?fectAMINE2000脂質體轉染，使之進行同源重組，第2 d傳代；轉染7～10 d后，75%～80%的細胞出現(xiàn)CPE時收集細胞，-80℃和37℃反復凍融3次釋毒，離心凍融液收集上清，即為第一代腺病毒載體Ad.H1-CTGF毒種，作為隨后大量病毒擴增的原液，3次擴增后獲得病毒保存液。同法獲得無關陰性對照病毒Ad.H1-Con原液及保存液，均于-80℃保存。病毒滴定采用TCID50法，即將病毒原液梯度稀釋至1/10-6～1/10-12，分別接種生長于96孔培養(yǎng)皿中的AD-293細胞，37℃培養(yǎng)72 h，用X-gal染色，計算病毒滴度。

1.5 空斑實驗檢測腺病毒載體的感染性

將肝星狀細胞系HSC-T6細胞低密度鋪于6孔板中，培養(yǎng)1 d后達60%～70%融合，用感染復數(shù)（MOI）為100的腺病毒載體Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染細胞，未感染病毒的細胞為對照，加甲基纖維素覆蓋液后37℃培養(yǎng)7 d，吸除覆蓋液加結晶紫染色，清洗后觀察空斑形成情況。

1.6 Western印跡檢測病毒載體對CTGF基因的沉默效果

圖1 腺病毒穿梭質粒pShuttle-H1圖譜及構建示意圖

表1 編碼siRNA的DNA雙鏈

HSC-T6細胞于6孔板中培養(yǎng)1 d達60%～70%融合后，用MOI為100的腺病毒載體Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染細胞，37℃培養(yǎng)48 h后裂解細胞、提取蛋白，進行SDS-PAGE，然后將蛋白條帶電轉移到硝酸纖維素膜上，以抗CTGF單克隆抗體為一抗（1∶10）、山羊抗鼠IgG-HRP抗體為二抗（1∶100）進行 Western印跡，檢測腺病毒載體對CTGF基因的沉默效果。

2 結果

2.1 含靶序列的單鏈寡核苷酸退火產物檢測

將合成的4對含靶序列、1對陰性對照序列的單鏈寡核苷酸于90℃溫育4 min、70℃溫育10 min，緩慢冷卻至室溫進行退火，用12%非變性PAGE檢測退火形成雙鏈DNA的效率，均達90%以上（圖2），提示退火產物合格，可用來構建腺病毒穿梭質粒。

2.2 腺病毒穿梭質粒p-shuttle-CTGF的鑒定

由腺病毒穿梭質粒pShuttle-H1圖譜（圖1）可看出，MCS中含有2個EcoRⅠ酶切位點，EcoRⅠ酶切后形成2個片段，大片段6600 bp，小片段為300 bp的H1啟動子序列。在BglⅡ和HindⅢ位點間插入合成的寡核苷酸靶序列后，小片段長度則變?yōu)?60 bp。電泳結果（圖3）顯示，陰性對照質粒p-shut?tle-H1酶切小片段為300 bp，陽性克隆質粒p-shut?tle-CTGF酶切小片段為360 bp，大片段均為6600 bp，初步證明重組腺病毒穿梭質粒構建正確?；厥?60 bp小片段進行測序，證實序列完全正確（基因序列略）。

圖2 退火產物電泳圖譜

圖3 重組腺病毒穿梭質粒p-shuttle-CTGF的酶切鑒定

2.3 腺病毒載體的滴定和感染性鑒定

采用TCID50法對病毒進行滴定，測出病毒保存液滴度為4×1010PFU/mL。用MOI為100的目標病毒Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染HSC-T6細胞，7 d后目標病毒Ad.H1-CTGF組和陰性對照病毒組Ad.H1-Con均有大量空斑形成，未感染病毒的HSC-T6細胞未見空斑形成，說明構建的目標病毒和陰性無關對照病毒均具有較好的感染性（圖4）。

2.4 腺病毒載體對CTGF基因沉默效果的Western印跡鑒定

Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，內參照蛋白β-actin的表達水平在6組之間無明顯差異；而CTGF蛋白表達在包裝的4組目標病毒感染HSC-T6細胞后均有不同程度降低，其中含靶序列TS3的病毒感染組降低最顯著；無關序列陰性對照病毒感染組CTGF蛋白表達與未感染細胞組一樣，未見降低（圖5）。提示構建的含TS3靶序列的腺病毒載體具有較好的沉默CTGF基因的效果，將其命名為Ad.H1-CTGF，可作為以后抗纖維化研究的工具。

3 討論

我國是肝病大國，隨著慢性肝病病程的延續(xù)，其纖維化的進程也一直持續(xù)，由于目前缺乏行之有效的根治辦法，這些人都面臨著肝硬化的潛在威脅，這已成了嚴峻的社會問題。因此，尋找有效的抗纖維化方法，阻止慢性肝病患者的肝硬化趨勢，已成為我國乃至全球亟待解決的問題。

圖4 包裝的腺病毒感染滴定

圖5 各組病毒對CTGF表達的影響

肝纖維化的成因，普遍認為與肝星狀細胞（HSC）的活化有關[6]，轉化生長因子β（TGF-β）是目前公認的致纖維化最強的細胞因子之一，其促纖維化作用主要是通過誘導其下游因子CTGF的表達，活化HSC來完成。業(yè)已證明，CTGF與肝、肺、腎等器官的纖維化、皮膚瘢痕形成、創(chuàng)傷修復及動脈粥樣硬化密切相關[7]。由于CTGF的生物學效應相對單一，主要介導TGF-β的促細胞增殖和細胞外基質（ECM）合成等作用，因此，阻斷CTGF表達或抑制其活性，可能是一種更特異、更有效的防止肝纖維化的手段。

RNAi技術具有高效性和高特異性，作為關閉基因的新技術，已被廣泛應用[8]。RNAi的產生需要向細胞內導入siRNA或在細胞內表達siRNA，前者是將體外合成的siRNA直接導入細胞，雖簡單，但導入的siRNA易降解，且以瞬時表達為主，目前已較少使用；后者通過表達siRNA的質?；虿《据d體在靶細胞內轉錄siRNA，發(fā)揮RNAi作用，因方便、穩(wěn)定和高效而成為主流方法。腺病毒載體可以直接、高效、穩(wěn)定地感染細胞，避免了質粒轉染效率低而帶來的不便，逐漸成為該領域的研究熱點[9-13]。

我們根據(jù)siRNA設計原則[4-5]，設計了4對針對CTGF基因的siRNA序列和1對無關陰性對照序列，退火形成雙鏈DNA后定向克隆至pShuttle-H1的H1啟動子下游，獲得腺病毒穿梭質粒p-shuttle-CTGF1-5，經酶切、測序鑒定無誤后與骨架質粒pAdEasy-1共轉染AD-293細胞，同源重組后獲得4株腺病毒載體和1株陰性對照病毒，空斑實驗證實它們均具有較好的感染性，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)4組目標病毒對HSC-T6細胞CTGF的表達均有不同程度的抑制，其中Ad.H1-CTGF3的抑制效果最好，抑制率達85%，達到了設計要求。該腺病毒載體的構建成功，將為抗纖維化的研究提供可行的工具，為肝纖維化和肝硬化的防治奠定基礎。

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