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        DEK真核表達載體的構建及其對p53啟動子活性的影響

        2013-10-29 09:36:58劉婕閆志風張亞楠林婭紅丁麗華葉棋濃
        生物技術通訊 2013年1期
        關鍵詞:螢光真核質(zhì)粒

        劉婕 ,閆志風 ,張亞楠 ,林婭紅 ,丁麗華 ,葉棋濃

        1.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所,北京 100850;2.解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科,北京 100853

        原癌基因dek最初是從急性髓系白血病患者骨髓細胞中以dek-can融合基因的形式分離而來的[1]。研究表明,DEK與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。DEK在許多惡性腫瘤如肝細胞癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤和宮頸癌中均有過表達[2-4]。DEK可以誘發(fā)人類乳頭狀瘤病毒(HPV)E7靶基因癌變,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。同時,在乳腺癌中DEK的表達也明顯升高,而且與腫瘤的分級、分型及淋巴結轉(zhuǎn)移相關,在惡性度高和晚期乳腺癌中可以作為一個特異性的靶基因。最近研究發(fā)現(xiàn),DEK與DNA結合影響染色質(zhì)重構和基因表達,并且可以抑制依賴p53蛋白和不依賴p53蛋白介導的細胞衰老和凋亡[6]。因此,我們從乳腺cDNA文庫中獲得了DEK全長編碼序列,構建了N端帶Flag標簽的真核表達載體。人胚腎293T細胞轉(zhuǎn)染效率高,常用來檢測真核基因的表達,我們將構建的DEK表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞,檢測其表達。為了檢測DEK在乳腺癌中的作用機制,我們利用構建的真核表達載體,在乳腺癌ZR75-1細胞中檢測了DEK對p53基因啟動子活性的影響,發(fā)現(xiàn)在ZR75-1細胞中,DEK降低了p53啟動子的活性。我們的研究為進一步檢測DEK在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定了基礎,并預示DEK可能成為將來檢測和治療乳腺癌的靶標。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        人胚腎293T細胞、乳腺癌ZR75-1細胞、p53全長啟動子報告基因質(zhì)粒均由本實驗室保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ,pfu酶和DNA連接酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取、膠回收和PCR回收試劑盒均為Pro?mega公司產(chǎn)品;PCR引物由北京賽百盛生物有限公司合成;轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000購自Invitro?gen公司;鼠抗人Flag抗體購自Bethyl Laboratories公司;兔抗人GAPDH和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體購自SantaCruz公司。

        1.2 DEK編碼序列的PCR擴增

        dek基因序列GenBank登錄號為NM_003472,根據(jù)GenBank中報告的序列設計用于PCR擴增的上游引物(5'-CGGGATCCATGTCCGCCTCGGCCCCTGC-3')和 下 游 引 物(5'-CGGAATTCTCAAGAAATTAG CTCTTTTACAG-3'),上下游引物5'端分別攜帶BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點。PCR模板為人乳腺文庫。PCR反應條件:95℃變性1 min;95℃變性30 s,58℃復性30 s,72℃延伸90 s,29個循環(huán);72℃再延伸7 min。PCR擴增所用的酶為pfu酶。

        1.3 pcDNA3-Flag載體的構建

        以乳腺文庫為模板,PCR擴增dek基因序列,切膠回收目的條帶,37℃下用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切dek基因片段與pcDNA3-Flag載體,4 h后切膠回收酶切產(chǎn)物,于16℃連接8 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取平板上的克隆至LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)4 h后提取質(zhì)粒進行PCR鑒定,鑒定為陽性的質(zhì)粒再經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定。

        1.4 Western印跡

        轉(zhuǎn)染后收集細胞,加入SDS加樣緩沖液,煮沸10 min,離心后取上清液進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h,加入用5%脫脂奶粉1∶1000稀釋的Flag抗體或1∶10 000稀釋的GAPDH抗體,室溫輕搖1 h,TBST洗膜3次,每次7 min,加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG,室溫輕搖1 h,TBST洗膜3次,每次7 min,用化學發(fā)光法顯色5 min,壓片顯影。

        1.5 螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性測定

        螢光素酶活性測定按Promega公司試劑說明進行。轉(zhuǎn)染24 h后棄培養(yǎng)基,用PBS洗1次,加入100 μL裂解緩沖液,室溫輕搖15 min,將細胞收集到1.5 mL離心管中,振蕩5 min,4℃、12 000 r/min離心5 min,收集上清,取15 μL上清液,用熒光計測定螢光素酶活性。

        再取上述上清液10 μL與90 μL含β-巰基乙醇(2.7 ml/L)的Z緩沖液混勻,加入20 μL 4 mg/mL的ONPG溶液,常溫放置至出現(xiàn)淺黃色,加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,測定 D420nm值,其中β-半乳糖苷酶活性用于校正細胞轉(zhuǎn)染效率,啟動子活性為細胞轉(zhuǎn)染效率校正后的螢光素酶活性。

        2 結果

        2.1 dek基因的PCR擴增

        以乳腺文庫為模板,用PCR方法擴增DEK全長編碼序列,長度應為1128 bp,DNA凝膠電泳結果與預期大小相符(圖1)。

        2.2 pcDNA-3-Flag-DEK載體的構建

        將PCR擴增的DEK編碼序列和pcDNA3-Flag用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切處理,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化,抗性篩選得到的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽性(未顯示)。PCR鑒定陽性者再用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定,酶切鑒定結果進一步表明雙酶切后在1128 bp處可見特異片段,而空載體對照無此片段(圖2)。DNA序列分析結果證實該插入片段為DEK編碼序列(結果未顯示)。

        2.3 pcDNA3-Flag-DEK載體在293T細胞內(nèi)的表達

        將上述陽性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染293T細胞,對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag空載體,24 h后裂解細胞,Western印跡檢測細胞內(nèi)DEK的表達,以GAPDH為內(nèi)參。結果見圖3,轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-DEK載體的細胞中表達相對分子質(zhì)量約43×103的特異性條帶,與預期結果相符,表明pcDNA3-Flag-DEK載體攜帶的DEK編碼序列能在293T細胞中表達。

        圖1 PCR擴增dek基因

        圖2 pcDNA-3-Flag-DEK的雙酶切鑒定

        2.4 不同劑量DEK對p53啟動子活性的影響

        p53全長啟動子報告基因質(zhì)粒與不同劑量DEK表達載體轉(zhuǎn)染ZR75-1乳腺癌細胞后,通過檢測螢光素酶活性,測定DEK對p53啟動子活性的影響。方法如前所述,啟動子活性為細胞轉(zhuǎn)染效率校正后的螢光素酶活性,即為螢光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性。結果見表1,與對照組相比,0.1 μg DEK的表達即可使p53啟動子活性降至約1/7;當DEK表達量增加至1 μg時,p53啟動子活性降至約1/20。表明DEK明顯抑制p53啟動子的活性,且對p53啟動子活性的調(diào)節(jié)呈劑量依賴關系(圖4,P<0.05)。因此,DEK可能是調(diào)控p53啟動子活性的新轉(zhuǎn)錄因子。

        3 討論

        dek在多種人類侵襲性腫瘤中均表達上調(diào),是很重要的癌基因。也有研究發(fā)現(xiàn),DEK過表達抑制HeLa細胞的衰老,并延長人膠質(zhì)細胞的壽命;DEK表達缺失可誘導宮頸癌細胞凋亡。因此,DEK可以抑制細胞衰老和細胞凋亡[6]。p53是人類很重要的抑癌基因,當細胞受到內(nèi)部或外部應激反應(如DNA損傷)時,p53蛋白被活化,并誘導細胞凋亡[7]。某些因素引起p53基因突變或功能喪失,是引發(fā)宮頸癌的重要因素,宮頸癌組織中突變型p53蛋白的表達率明顯高于慢性宮頸炎。Trisha等發(fā)現(xiàn),DEK通過促進p53的降解而抑制細胞凋亡,且DEK抑制p53下游基因p21和Bax的表達[6]。為了進一步研究DEK在腫瘤中的作用,我們構建了DEK的真核表達載體,發(fā)現(xiàn)DEK明顯抑制p53啟動子的活性。因此,除已報道的DEK在蛋白水平調(diào)節(jié)p53表達[8]外,我們首次發(fā)現(xiàn)DEK在轉(zhuǎn)錄水平同樣抑制p53啟動子活性,可能是調(diào)節(jié)p53表達的新的轉(zhuǎn)錄因子,說明DEK在p53的功能發(fā)揮中具有重要的調(diào)控作用。后續(xù),我們將進一步研究DEK調(diào)節(jié)p53啟動子的功能及機制。綜上,我們成功地得到DEK表達載體,為進一步研究DEK在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制,以及臨床分子靶向治療奠定了基礎。

        圖3 Western印跡檢測Flag-DEK在293T細胞中的表達

        圖4 不同劑量DEK對p53啟動子活性的影響

        表1 不同劑量DEK對p53啟動子活性的影響的實驗結果(x±s)

        [1]von Lindern M,Fornerod M,van Baal S,et al.The transloca?tion(6;9),associated with a specific subtype of acute myeloid leukemia,results in the fusion of two genes,dek and can,and the expression of a chimeric,leukemia-specific dek-can mRNA[J].Mol Cell Biol,1992,12(4):1687-1697.

        [2]Wu Q,Li Z,Lin H,et al.DEK overexpression in uterine cer?vical cancers[J].Pathol Int,2008,58(6):378-382.

        [3]Wise-Draper T M,Mintz-Cole R A,Morris T A,et al.Over?expression ofthe cellularDEK protein promotesepithelial transformation in vitro and in vivo[J].Cancer Res,2009,69(5):1792-1799.

        [4]Carro M S,Spige F M,Quarto M,et al.DEK expression is controlled by E2F and deregulated in diverse tumor types[J].Cell Cycle,2006,5:1202-1207.

        [5]Wise-Draper T M,Allen H V,Thobe M N,et al.The hu?man DEK proto-oncogene is a senescence inhibitor and an upregulated target of high-risk human papillomavirus E7[J].J Virol,2005,79:14309-14317.

        [6]Wise-Draper T M,Allen H V,Jones E E,et al.Appotosis inhibition by the human DEK oncoprotein involves interfer?ence with p53 functions[J].Mol Cell Biol,2006,26:7506-7519.

        [7]Vogelstein B,Lane D,Levine A J.Surfing the p53 network[J].Nature,2000,408(6810):307-310.

        [8]Kim D W,Chae J I,Kim J Y,et al.Proteomic analysis of apoptosis related proteins regulated by proto-oncogene protein DEK[J].J Cell Biochem,2009,106(6):1048-1059.

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