薛彩霞，趙艷軍，王寶軍，李雙志，劉 婧，梁鎮(zhèn)海

（1.太原理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，太原 030024；2.內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院 化學(xué)工程系，呼和浩特 010070）

土壤的鹽漬化是一個(gè)國(guó)際性的環(huán)境問(wèn)題，鹽漬化引起了植物生長(zhǎng)環(huán)境的變化，嚴(yán)重制約了植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[1]。鹽漬化的問(wèn)題較為嚴(yán)重，所以近年來(lái)科學(xué)家們致力于研究植物種子及幼苗耐鹽能力以改進(jìn)植物種子的質(zhì)量[2]。鹽脅迫對(duì)植物種子的危害是多方面的，有滲透脅迫[3]、離子的毒害[4]、養(yǎng)分失調(diào)[5]等，由此而產(chǎn)生次級(jí)的氧化脅迫，引起植物細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)生理障礙，甚至導(dǎo)致植物的死亡[6-8]。因此對(duì)植物耐鹽性能的研究在鹽漬地的開(kāi)發(fā)和利用中發(fā)揮著及其重要的作用，而且是迫切需要解決的一個(gè)重大的環(huán)境問(wèn)題。已有研究表明，電場(chǎng)處理植物種子可以改變植物的生理生化機(jī)能，對(duì)種子的萌發(fā)、活性、幼苗生長(zhǎng)、植物生育性狀以及產(chǎn)量具有顯著影響[9-11]。這些事實(shí)表明，通過(guò)電場(chǎng)處理種子可以提高種子生長(zhǎng)的抗鹽性[12-13]。電化學(xué)方法有很強(qiáng)的電磁場(chǎng)效應(yīng)，但利用電化學(xué)方法處理種子的方法國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本文采用電解質(zhì)為硫酸鈉溶液的電化學(xué)方法處理小麥種子，通過(guò)NaCl溶液脅迫育種考察電化學(xué)方法抗鹽脅迫的能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山西省農(nóng)科院提供的冬豐1號(hào)小麥種子；配制電解質(zhì)溶液所用的試劑為分析純的無(wú)水Na2SO4溶液，購(gòu)自焦作市化工三廠；消毒小麥種子所用的試劑為分析純的NaClO溶液，購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；脅迫育種實(shí)驗(yàn)所用的試劑為分析純的NaCl溶液，購(gòu)自天津市津南區(qū)咸水沽工業(yè)園區(qū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）根據(jù)種子的自身特點(diǎn)和萌發(fā)的基本規(guī)律，選擇顆粒飽滿的小麥種子為研究對(duì)象，將其置入100 mL的小燒杯中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaClO溶液消毒10min左右，用清水清洗23次。

2）在上述燒杯中加入濃度為6×10-2mol／L的Na2SO4溶液作為電解質(zhì)溶液，選擇鈦基氧化物電極和鈦板分別作為電化學(xué)方法的陽(yáng)極和陰極，設(shè)計(jì)出電解槽，選擇電壓為8V的直流穩(wěn)壓電源處理小麥種子2.0h，其中選擇清水浸種和Na2SO4溶液浸種為小麥種子處理的對(duì)照組。

3）將處理后的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入定量的一定濃度的NaCl溶液（c（NaCl）＝0，0.05，0.10，0.50mol／L），將培養(yǎng)皿放入恒溫光照培養(yǎng)箱中催芽，生長(zhǎng)條件為晝夜溫度25℃／20℃，各處理組的萌發(fā)條件都相同。每皿含有50粒種子，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。其中，對(duì)照組CK中每天加入等量的二次去離子水作為對(duì)照。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定方法

1.3.1 種子表觀特性的測(cè)定方法

記錄種子的發(fā)芽時(shí)間及發(fā)芽情況，并計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)Gp＝（規(guī)定日期全部正常發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)）×100%；Gp以發(fā)芽高峰期第3天的發(fā)芽率為準(zhǔn)。發(fā)芽率Gr＝（全部正常發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)）×100%；Gr以發(fā)芽第7天的發(fā)芽率為準(zhǔn)。

1.3.2 種子淀粉酶活性測(cè)定方法

淀粉酶活性的測(cè)定采用分光光度法[14]。其中，淀粉酶活性濃度單位為U，以25℃時(shí)3min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位。

1.3.3 種子過(guò)氧化物酶活性測(cè)定方法

過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[15]，其中，以用1min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U）表示。

1.3.4 種子丙二醛含量的測(cè)定方法

丙二醛（MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)計(jì)算每個(gè)處理組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的平均值和方差。方差分析后，采用t檢驗(yàn)，檢測(cè)不同處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性（＊為0.05水平差異顯著，＊＊為0.01水平差異顯著）。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaCl脅迫對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響

小麥種子經(jīng)NaCl溶液脅迫培養(yǎng)萌發(fā)后，其發(fā)芽勢(shì)（圖1）和發(fā)芽率（圖2）都發(fā)生了變化。從圖1和圖2可以看出，經(jīng)NaCl脅迫實(shí)驗(yàn)后，小麥種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率整體上有所降低；隨著NaCl濃度的增加，小麥種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率也逐漸降低，說(shuō)明NaCl脅迫降低了小麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。但從表1和表2可以看出，雖然清水浸種、Na2SO4溶液浸種和電化學(xué)方法處理這三組實(shí)驗(yàn)中，NaCl脅迫都使其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率下降，但降低的幅度有所區(qū)別，降幅由大到小依次為：Na2SO4溶液浸種，清水浸種，電化學(xué)方法處理。特別是當(dāng)NaCl濃度為0.5mol／L時(shí)，這三組實(shí)驗(yàn)的降幅差異最大，說(shuō)明了適宜的電化學(xué)方法處理種子能夠提高小麥種子的抗NaCl能力，降低小麥種子對(duì)NaCl環(huán)境的敏感程度。

圖1 NaCl脅迫對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)的影響

圖2 NaCl脅迫對(duì)小麥種子發(fā)芽率的影響

表1 NaCl脅迫對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)變化的影響

表2 NaCl脅迫對(duì)小麥種子發(fā)芽率變化的影響

2.2 NaCl脅迫對(duì)小麥幼苗淀粉酶活性的影響

圖3和表3反映了NaCl脅迫育種對(duì)不同處理方式的小麥淀粉酶活性的變化影響?？梢钥闯?，對(duì)于同樣的處理方式，經(jīng)過(guò)NaCl脅迫育種的小麥種子其淀粉酶活性均低于未經(jīng)過(guò)脅迫的種子，且隨著NaCl濃度的增加，淀粉酶活性逐漸下降。說(shuō)明了NaCl脅迫抑制了小麥淀粉酶的合成，降低了淀粉酶水解淀粉的能力，減緩了種子新陳代謝，進(jìn)而降低了種子的活性。但是從表3中可以看出，在相同濃度的NaCl脅迫下，各處理方式下的淀粉酶活性由大到小依次為：Na2SO4溶液浸種，清水浸種，電化學(xué)方法處理；且NaCl濃度越大，這種趨勢(shì)越明顯。這說(shuō)明適宜劑量的電化學(xué)方法處理小麥種子可以抵制NaCl脅迫，利用電化學(xué)方法的強(qiáng)電磁場(chǎng)效應(yīng)激活細(xì)胞中水解酶的合成，加快了細(xì)胞的新陳代謝，起到抗NaCl的能力。

圖3 NaCl脅迫對(duì)淀粉酶活性的影響

表3 NaCl脅迫對(duì)淀粉酶活性變化的影響

2.3 NaCl脅迫對(duì)小麥幼苗過(guò)氧化物酶活性的影響

過(guò)氧化物酶（POD）作為一種清除自由基團(tuán)的保護(hù)酶之一，參與了許多的生理生化活動(dòng)，如細(xì)胞的分裂和種子生長(zhǎng)發(fā)育等。POD活性的維持和提高是種子抗鹽脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

圖4表明，對(duì)于同種處理種子的方式，小麥葉子的POD活性整體上隨著NaCl濃度的增加而逐漸降低，而且NaCl脅迫育種的小麥POD活性均低于對(duì)照組，說(shuō)明NaCl脅迫抑制了小麥自由基的合成，從而抑制了POD的激活，降低了POD清除自由基的能力，進(jìn)而減緩了種子新陳代謝，降低了種子的活性。但從表4中可以看出，在同一濃度的NaCl脅迫下，各處理方式下的POD活性由大到小依次為：Na2SO4溶液浸種，清水浸種，電化學(xué)方法處理。彼此之間的變化規(guī)律不是很明顯，而且在相同濃度的NaCl脅迫下，電化學(xué)方法處理的POD活性高于Na2SO4溶液浸種和清水浸種下的POD活性。該結(jié)果可以說(shuō)明適宜的電化學(xué)方法可以激活種子細(xì)胞自由基含量，從而刺激POD的合成，達(dá)到抗NaCl的能力。

圖4 NaCl脅迫對(duì)過(guò)氧化物酶活性的影響

表4 NaCl脅迫對(duì)過(guò)氧化物酶活性變化的影響

2.4 NaCl脅迫對(duì)小麥幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受到破壞的重要標(biāo)志之一[17]。在逆境脅迫或植物衰老過(guò)程中，它可以與膜上的蛋白質(zhì)和酶蛋白結(jié)合失去活性，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能，甚至導(dǎo)致植物受傷，乃至死亡[18]。因此MDA含量可以作為評(píng)價(jià)種子在脅迫條件下發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用強(qiáng)弱的指標(biāo)，而且過(guò)氧化越強(qiáng)，MDA含量越高[19]。MDA的含量可以代表細(xì)胞膜的損傷程度大小。由圖5可見(jiàn)，采用同樣處理種子的方式，小麥葉片的MDA含量隨著NaCl脅迫濃度的增加而逐漸降低，說(shuō)明在NaCl脅迫下，MDA含量的增加導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞，細(xì)胞受損傷，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)。從表5中可以看出，在同一濃度的NaCl脅迫下，各處理方式下的MDA含量變化由大到小依次為：Na2SO4溶液浸種，清水浸種，電化學(xué)方法處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適宜的電化學(xué)方法可以增大種子細(xì)胞介質(zhì)電勢(shì)，減小離子的外滲，增強(qiáng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完善，進(jìn)而恢復(fù)細(xì)胞膜的半透性功能，起到提高種子活性的作用。

圖5 NaCl脅迫對(duì)小麥幼苗MDA含量的影響

表5 NaCl脅迫對(duì)MDA含量的影響

3 電化學(xué)方法抗NaCl能力的機(jī)理分析

電化學(xué)方法能夠產(chǎn)生一個(gè)綜合的電磁場(chǎng)效應(yīng)。電化學(xué)方法作用在細(xì)胞膜上，等于作用在等價(jià)RC電路上，由于生物組織分布的不均勻性導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外電解質(zhì)溶液中電流的不同，從而使得種子內(nèi)細(xì)胞膜的膜電位發(fā)生變化，即極化的種子膜兩側(cè)出現(xiàn)附加電荷（如圖6所示），從而改變了細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)了酶和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的合成，各種酶的活性隨之增強(qiáng)，進(jìn)一步影響了細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)纫磺屑?xì)胞代謝活動(dòng)和生理狀態(tài)[20]（見(jiàn)圖3，圖4），從而使細(xì)胞膜得以修復(fù)，促使膜內(nèi)外離子交換加快，抵制了NaCl脅迫環(huán)境下對(duì)細(xì)胞膜的破壞，使細(xì)胞的抗NaCl能力增強(qiáng)（見(jiàn)圖1，圖2）。

圖6 電化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞膜電位的影響

將電化學(xué)方法作用于細(xì)胞膜兩側(cè)，細(xì)胞膜受到化學(xué)方法作用，細(xì)胞內(nèi)外離子的交換速度加快，進(jìn)而為細(xì)胞代謝提供了所需的離子。雖然所處環(huán)境為NaCl脅迫環(huán)境，但細(xì)胞膜透性的增加可以使水分、氧氣和一些植物所需的微量元素滲入種子細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞萌發(fā)提供了一定的養(yǎng)分，使種子細(xì)胞不致失水而死，從而促使種子進(jìn)行萌發(fā)生長(zhǎng)。而且，外加電化學(xué)方法可以提高細(xì)胞內(nèi)葡萄糖、脂肪及各類氨基酸的脫氫過(guò)程，更形成還原型輔酶沿電子傳遞途徑及以e-和H＋形式傳遞給氧而形成水，促使釋放的自由能形成ATP，進(jìn)而影響到整個(gè)細(xì)胞生理生化過(guò)程[21]（其氧化磷酸化過(guò)程如圖7所示）。

圖7 氧化與磷酸化偶聯(lián)示意圖

4 結(jié)論

通過(guò)比較電化學(xué)處理、清水浸種和Na2SO4溶液浸種不同處理方式的小麥種子NaCl脅迫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三種處理方式的幼苗期生理指標(biāo)均隨NaCl濃度的變化而變化，其中種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及酶活性指標(biāo)隨著NaCl濃度的增加而逐漸降低，MDA含量則逐漸增加。這說(shuō)明過(guò)高濃度的NaCl對(duì)小麥種子萌發(fā)生長(zhǎng)起到一定的抑制作用；在同濃度NaCl脅迫下，電化學(xué)方法的小麥發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、淀粉酶活性和過(guò)氧化物酶活性相比于清水浸種和Na2SO4溶液浸種的小麥分別提高了6.00%～14.67%、4.66% ～11.33%、8.95～11.42U 和 23.38～29.20U，而丙二醛含量則降低了0.45～.07μmol／L，說(shuō)明電化學(xué)方法處理能夠明顯增加小麥種子萌發(fā)生長(zhǎng)的抗NaCl能力；三種處理方式抗NaCl脅迫的能力排序由大到小依次為：電化學(xué)方法處理，清水浸種，Na2SO4溶液浸種。

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