武潤平，李巧玲，劉曉霞，萬郁楠，續(xù)麗麗，李洪剛

（中北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，山西 太原 030051）

殼聚糖是一種常用的靶向藥物載體生物材料，它具有無毒﹑無害的性質(zhì)，且具有良好的生物相容性和降解性[1～3]，但是殼聚糖只溶于酸或弱酸性溶液中，這大大限制了它的應(yīng)用范圍。將殼聚糖進(jìn)行羧甲基化，可以大大改良?xì)ぞ厶堑男再|(zhì)。與傳統(tǒng)的殼聚糖相比，羧甲基殼聚糖生物相容性更好，更易降解，性質(zhì)更穩(wěn)定，而且對負(fù)載藥物無pH 值要求[4]。

傳統(tǒng)的腫瘤治療方法不僅會殺死腫瘤細(xì)胞，也會對正常細(xì)胞有毒性作用。葉酸化學(xué)性質(zhì)簡單，方便易得，無免疫原性，且葉酸對葉酸受體具有高度的親和性[5～6]，所以葉酸常作為葉酸的受體在腫瘤治療中起到了顯著的作用。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)均是將葉酸直接偶聯(lián)到藥物載體，對葉酸偶聯(lián)水溶性殼聚糖載體報(bào)道較少。所以本文將殼聚糖的羥基進(jìn)行羧甲基化，再將葉酸偶聯(lián)至水溶性的O-羧甲基殼聚糖的活性基團(tuán)氨基，得到葉酸偶聯(lián)O-羧甲基殼聚糖(FCC)，能夠較好地溶于中性和堿性溶液，且水溶性殼聚糖上較好地偶聯(lián)葉酸分子，以期能夠在靶向藥物治療中得到很好的應(yīng)用。

1 試劑與儀器

殼聚糖(chitosan，分析純)，一氯乙酸(chloroacetic acid，分析純)，異丙醇(isopropanol，分析純)，葉酸(folic acid，分析純)，二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，化學(xué)純)，N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，分析純)，其他藥品和試劑均為分析純。

FT-IR-Nicolet5700 型紅外光譜儀， 751GD 型紫外 - 可見分光光度計(jì)，透析袋等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 O-羧甲基殼聚糖的制備

準(zhǔn)確稱取3g 殼聚糖粉末，將其懸浮于40%的NaOH 溶液中，向其中緩慢滴加40mL 異丙醇后，冷凍過夜；向混合物中緩慢滴加氯乙酸和異丙醇的混合溶液在50℃下攪拌（分5 次滴加，每次間隔1h）。反應(yīng)5h 后將混合物靜置分層，棄上清液并加少量蒸餾水，然后用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH 至7，抽濾后用無水乙醇洗滌，最后冷凍干燥得O-羧甲基殼聚糖（OCMCs）。

2.2 葉酸偶聯(lián)O-羧甲基殼聚糖的制備

稱取葉酸（FA）0.3g，N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），將其溶解于15mL 二甲基亞砜（DMSO）中，室溫避光攪拌至葉酸全部溶解；然后向混合物中加入0.15g O-羧甲基殼聚糖（O-CMCS）和30mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH=5.0），避光室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜，調(diào)pH 至9.0；分別用磷酸緩沖溶液和蒸餾水各透析3d，冷凍干燥得黃色粉末狀固體（FCC）。

3 結(jié)果與討論

3.1 FCC 的紅外光譜表征

由圖1 中(a)線可以看出，3416cm-1處的強(qiáng)吸收峰是-OH 和-NH2的特征吸收峰部分重疊的結(jié)果；1162cm-1﹑1077cm-1﹑1653cm-1的 吸 收 峰 分 別 是C-O-C﹑C-O 和乙?；蠧=O 的伸縮振動吸收峰；891cm-1處是伯胺-NH2的吸收帶；891cm-1處是伯胺-NH2面內(nèi)彎曲振動強(qiáng)吸收峰；1314cm-1較弱的吸收峰是C-N 縮振動,說明殼聚糖的氨基未被破壞，成功制得O-羧甲基殼聚糖。

圖1(b)線是O-羧甲基殼聚糖接枝葉酸樣品的紅外光譜圖。由圖可知，1670cm-1對應(yīng)于反應(yīng)生成的酰胺鍵的吸收峰，對應(yīng)于O-羧甲基殼聚糖的1722cm-1處有所增強(qiáng)；1580cm-1處由于引入了葉酸分子的苯環(huán)而得到增強(qiáng)；2970cm-1附近的吸收峰對應(yīng)于-CH3中C-H 伸縮振動峰，1098cm-1處的吸收峰是醚鍵，此處的峰相對于羧甲基殼聚糖的振動吸收有所增強(qiáng)。這些都表明葉酸與羧甲基殼聚糖發(fā)生了偶聯(lián)。

圖1 葉酸偶聯(lián)O-羧甲基殼聚糖的IR 圖Fig.1 The IR of Folate O-carboxymethyl chitosan(FCC)

3.2 O-羧甲基殼聚糖中羧甲基取代度的測定

精密稱取0.5g 所得O-羧甲基殼聚糖（O-CMCS）溶于50mL 0.1mol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液中，置于磁力攪拌器上完全溶解；用0.1mol·L-1的NaOH 溶液滴定上述溶液，用pH 計(jì)記錄讀數(shù)變化；利用二次微商法做圖。

圖2 O-羧甲基殼聚糖的取代曲線Fig.2 The replace curve of O-carboxymethyl chitosan(O-CMCS)

如圖2 所示，pH 為2.1 處為滴定過量鹽酸的小突越點(diǎn)，消耗NaOH 溶液體積為29.40mL，在pH 為4.3 處出現(xiàn)第一個(gè)突越峰，為-OH 位羧甲基的滴定終點(diǎn)，消耗NaOH 溶液的體積為V2=37.90mL。將其帶入公式DS=0.203A/（1-0.058A），A=( V1-V2)×C/W，得DS=38.28%。

3.3 O-羧甲基殼聚糖的溶解性

稱取0.5g 所得 O-羧甲基殼聚糖和殼聚糖，將其分別溶于pH 為3.0﹑3.5﹑4.0﹑4.5﹑5.0﹑5.5﹑6.0﹑6.5﹑7.0﹑7.5﹑8.0﹑8.5﹑9.0 的水溶液中，離心分離；取上清液用紫外分光光度計(jì)在200nm 處對其進(jìn)行檢測；將剩余的固體干燥稱重，可得圖3。

圖3 殼聚糖和O-羧甲基殼聚糖的溶解性Fig.3 The Solubility of chitosan and O-carboxymethyl chitosan

由圖3 可知，殼聚糖在弱酸性溶液中有較好的溶解性，隨著pH 值的升高溶解性下降，當(dāng)殼聚糖溶液的pH 值增至7 以上時(shí)，溶解度極?。欢鳲-羧甲基殼聚糖在pH 值為3 以下時(shí)有較好的溶解性，在pH為4～6 時(shí)溶解性較差，在pH 值大于7 的溶液中同樣有較好的溶解性，說明所制得的O-羧甲基殼聚糖在弱酸﹑弱堿以及中性溶液中均可溶。

3.4 葉酸偶聯(lián)O-羧甲基殼聚糖中葉酸的修飾量

精密稱取葉酸10.0mg 溶于50mL 水中，將其稀釋定容至100mL，分別取1.0﹑1.5﹑2.0﹑3.0﹑4.0mL的葉酸溶液，再用去離子水稀釋至10mL。以去離子水為空白對照，用紫外分光光度計(jì)在波長281nm處測定吸光度，以葉酸濃度對吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取25mg O-羧甲基殼聚糖接枝葉酸（FCC）溶于去離子水中，定容至100mL，用紫外分光光度計(jì)檢測FA 的含量，檢測波長為281nm，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每mg O-羧甲基殼聚糖接枝葉酸（FCC）中葉酸的含量，得線性回歸方程：y=44.2845x+0.1655，r2=0.9983。由線性回歸方程計(jì)算得到葉酸的修飾量為17.8μg·mg-1，相當(dāng)于O-羧甲基殼聚糖中每個(gè)羧甲基殼聚糖上大約偶聯(lián)2 個(gè)葉酸分子。由于平均1個(gè)蛋白分子上偶聯(lián)3 個(gè)葉酸分子就有很強(qiáng)的靶向性，所以我們認(rèn)為已成功地在殼聚糖表面修飾了足量的葉酸。

4 結(jié)論

一系列的表征手段顯示，本研究成功地制備了O-羧甲基殼聚糖，它能夠較好地溶于中性和堿性溶液，并在殼聚糖表面修飾了足量的葉酸，以期使葉酸偶聯(lián)O-羧甲基殼聚糖作為靶向載體能夠更好地應(yīng)用于抗腫瘤細(xì)胞的研究當(dāng)中。

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