李 芳 劉向榮 閆 峰 張陳誠(chéng) 羅玉敏 方伯言 吉訓(xùn)明*

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧錦州 121001;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京 100053;3.航天中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100049)

隨著人口老齡化的到來(lái)，缺血性腦血管病的發(fā)病率逐年上升，給家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。目前對(duì)缺血性腦血管病的公認(rèn)有效治療方法仍為超早期溶栓治療，但溶栓后不可避免地造成腦缺血再灌注損傷。亞低溫是指維持組織處于32℃ ～34℃，國(guó)內(nèi)外研究［1-2］發(fā)現(xiàn)亞低溫可以通過(guò)多種途徑減輕腦缺血再灌注后損傷。腦缺血再灌注損傷可造成血腦脊液屏障(blood-brain barrier，BBB)的顯著破壞。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)主要作用于膠原(Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ)和層黏連蛋白(laminin，LN)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分［3］，可導(dǎo)致 BBB 的損傷。LN和FN是基底膜的組成部分，是維持BBB完整性的重要蛋白質(zhì)。嚴(yán)重的BBB破壞可以導(dǎo)致血管源性的腦水腫、顱內(nèi)高壓和腦缺血后致命性的出血轉(zhuǎn)化［4］。

本實(shí)驗(yàn)主要探討局部亞低溫處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)MMP9、LN及FN表達(dá)的影響，探明局部亞低溫是否通過(guò)改變MMP9、LN及FN的表達(dá)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取清潔級(jí)、成年健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量280～310 g，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供并飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2008－0001。

1.1.2 主要試劑及儀器

2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購(gòu)自美國(guó) Amresco公司，MMP9兔源多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，F(xiàn)N和LN兔源多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate，TRITC)標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗為美國(guó)Jackson Immuno Research Laboratories公司產(chǎn)品。含4'，6－二脒基－2－苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的封片劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。熒光顯微鏡Nikon 80i為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立

改良線栓法［5］制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，缺血時(shí)間為2 h。模型制作采用數(shù)字表法隨機(jī)分7組:①假手術(shù)組(sham組，n=5);②正常體溫再灌注4 h對(duì)照組(N-4 h組，n=5);③局部亞低溫再灌注4 h組(H-4 h組，n=5);④正常體溫再灌注24 h對(duì)照組(N-24 h組，n=10)⑤局部亞低溫再灌注24 h組(H-24 h組，n=10);⑥正常體溫再灌注72 h對(duì)照組(N-72 h組，n=5);⑦局部亞低溫再灌注72 h組(H-72 h組，n=5)。

大鼠稱(chēng)體質(zhì)量后，5%恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O及30%O2維持麻醉。取頸部正中切口，分離右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。于頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端1.5 cm處結(jié)扎、電灼、切斷其相應(yīng)分支。將頭端直徑0.26 mm線栓由右側(cè)頸外動(dòng)脈斷端經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉至右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，緩慢進(jìn)線至有輕微阻擋感，此時(shí)線栓頭端位于右側(cè)大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處。栓塞2 h后，取出線栓，電凝頸外動(dòng)脈斷端。局部亞低溫再灌注組于缺血即刻在大鼠頭部放置冰塊，測(cè)溫探頭插入顳肌中，監(jiān)測(cè)腦溫維持于32.5℃ ～33.5℃，并持續(xù)至再灌注后1 h，低溫共持續(xù)3 h，自動(dòng)控溫電熱毯使肛溫維持于36.5℃～37.5℃。正常體溫再灌注組除頭部不放置冰塊，其余均與局部亞低溫再灌注組一致。假手術(shù)組只分離暴露血管，不結(jié)扎頸外動(dòng)脈，不插入尼龍魚(yú)線。分別于再灌注4 h、24 h和72 h時(shí)處死大鼠，收集標(biāo)本。假手術(shù)組于手術(shù)后24 h處死，取標(biāo)本。

1.2.2 腦梗死體積測(cè)定

缺血再灌注24 h組大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛2 mL，誘導(dǎo)過(guò)度麻醉后，迅速斷頭取腦，橫斷面由前向后，取視交叉前4 mm及其后大腦做連續(xù)冠狀切片(層厚2 mm)，共取6片。將切片置于1.5%TTC溶液中，37℃避光孵育至大腦切片著色。TTC染色后可見(jiàn)正常腦組織呈成紅色，梗死組織不著色。以Image J軟件畫(huà)圖分析計(jì)算梗死體積比(%)。梗死體積比(%)=(健側(cè)大腦半球體積－梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積)/健側(cè)大腦半球體積×100%。健側(cè)大腦半球體積=(A1+A2+……+A6)×H。梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積=(A1'+A2'+……+A6')×H。其中，An表示每張腦片健側(cè)大腦面積，An'表示每張腦片梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦面積，H表示腦片厚度。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能測(cè)定

神經(jīng)功能測(cè)定采用Ludmila Belayev12分評(píng)分法［6］于再灌注24 h進(jìn)行。(1)姿勢(shì)反射測(cè)驗(yàn)，即提尾懸空試驗(yàn):無(wú)明顯神經(jīng)功能缺失為0分，梗死對(duì)側(cè)肢體屈曲為1分，側(cè)推試驗(yàn)陽(yáng)性為2分。(2)前肢放置試驗(yàn):①視覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，即前方刺激。實(shí)驗(yàn)者將動(dòng)物握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方10 cm處向桌面緩慢斜線靠近(此時(shí)桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反應(yīng)為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應(yīng)延遲。0分:動(dòng)物肢體放置反應(yīng)正常;1分:反應(yīng)延遲但不超過(guò)2 s;2分:反應(yīng)延遲且超過(guò)2 s。側(cè)方刺激，此時(shí)桌子位于動(dòng)物側(cè)方，其余實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同前方刺激。②觸覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物雙眼遮住，并使其前爪懸空，此時(shí)大鼠既看不見(jiàn)，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側(cè)輕觸桌面，刺激深度僅達(dá)皮膚和毛發(fā)，動(dòng)物反應(yīng)及評(píng)分同視覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，觸覺(jué)刺激同樣分前方及側(cè)方刺激。③本體覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，操作及評(píng)分同觸覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)，僅刺激深度不同，本體覺(jué)亞實(shí)驗(yàn)給予前爪較大壓力，刺激深達(dá)肌肉及關(guān)節(jié)。該亞實(shí)驗(yàn)只有前方刺激。前肢放置實(shí)驗(yàn)總分范圍0～10分，神經(jīng)功能缺損越重，得分越高。

1.2.4 免疫熒光測(cè)定各組大鼠MMP9、FN及LN的表達(dá)

大鼠斷頭取腦，4%多聚甲醛(pH 7.0)固定48 h，以2 mm層厚將鼠腦均勻切為5片。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后在切片機(jī)上連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm。組織切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、下行梯度乙醇水化，0.3%H2O2/甲醇溶液10 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，20 mg/L蛋白酶K室溫作用30 min修復(fù)抗原，3%小牛血清室溫封閉30 min阻止抗原非特異性結(jié)合后，一抗?jié)窈兄?℃孵育過(guò)夜。熒光二抗室溫孵育30 min后，DAPI封片，顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照除未用一抗孵育外，其余與上述步驟一致。抗體稀釋比例如下:MMP9(1 ∶50)，LN(1 ∶525)，F(xiàn)N(1 ∶540)，TRITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:200)。采用Carl Zeiss公司的圖像分析器檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)域MMP9、LN和FN的免疫熒光強(qiáng)度，采用-log(檢測(cè)區(qū)域的大腦吸光度/陰性對(duì)照吸光度)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，均數(shù)兩兩比較采用Student Newman Keuls法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積測(cè)定結(jié)果

TTC是1種水溶性鹽類(lèi)物質(zhì)，可以與細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶反應(yīng)生成深紅色脂溶性物質(zhì)。缺血2 h再灌注24 h組大鼠右額、頂葉皮質(zhì)和基底節(jié)等缺血區(qū)因線粒體脫氫酶失活不染色呈蒼白色，周?chē)＝M織染成均勻的深紅色。TTC染色結(jié)果經(jīng)Image J軟件分析，H-24 h組的腦梗死體積(18.34±7.06)%較N-24 h組(37.12±4.61)%減小，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 腦梗死體積結(jié)果Fig.1 Results of cerebral infarction volume

2.2 大鼠神經(jīng)功能測(cè)定結(jié)果

與N-24 h組(8.30±1.16)相比，H-24 h組神經(jīng)功能評(píng)分(6.50±1.43)顯著降低(P=0.006)，神經(jīng)功能明顯改善，詳見(jiàn)圖2。

圖2 神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果Fig.2 Results of neurologic deficits score

2.3 免疫熒光檢測(cè)MMP9結(jié)果

H-4 h組、H-24 h組大鼠腦組織MMP9表達(dá)均降低，與N-4 h組、N-24 h組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見(jiàn)圖3。

2.4 免疫熒光檢測(cè)LN及FN結(jié)果

給予局部亞低溫處理，H-4 h組大鼠腦組織LN及FN表達(dá)均較N-4 h組升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖4。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程［7］。在缺血再灌注過(guò)程中，BBB結(jié)構(gòu)和功能常遭破壞。BBB由內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接、包繞血管的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、周細(xì)胞及其間的基底膜等形成并維持其功能［8］。毛細(xì)血管外周的ECM泛指細(xì)胞分泌的以基底膜或不定形式存在于細(xì)胞外間隙的分子，主要有IV型膠原、LN、FN、硫酸乙酞蛋白多糖等，對(duì)血液中的物質(zhì)經(jīng)過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腦起了電荷屏障和分子篩的作用。BBB破壞基礎(chǔ)上ECM的構(gòu)成變化，可以直接影響神經(jīng)系統(tǒng)疾病的演變［9］。

Rosenberg等［10］研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷后數(shù)小時(shí)BBB開(kāi)放，但此時(shí)的開(kāi)放是短暫的，隨后24 h至48 h BBB有一個(gè)更嚴(yán)重的破壞。我們發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，正常體溫再灌注4 h MMP9表達(dá)即增加，24 h達(dá)高峰，這與血腦脊液屏障的第2次開(kāi)放時(shí)間一致，表明MMP9可能參與血腦脊液屏障的破壞。而局部亞低溫再灌注4 h組MMP9表達(dá)無(wú)明顯增加，提示局部亞低溫在缺血再灌注早期即可抑制MMP9的表達(dá)。局部亞低溫再灌注24 h、72 h組MMP9表達(dá)雖較假手術(shù)組增加，但分別較正常體溫再灌注24 h、72 h組表達(dá)下降，說(shuō)明局部亞低溫處理可在缺血再灌注4 h～24 h明顯抑制MMP9的表達(dá)。同時(shí)，局部亞低溫處理再灌注24 h可減少腦梗死體積，改善大鼠神經(jīng)功能，提示局部亞低溫處理可能在缺血再灌注早期通過(guò)抑制MMP9的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。目前，局部亞低溫處理導(dǎo)致MMP9表達(dá)下調(diào)的機(jī)制還沒(méi)有確切報(bào)道。腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以刺激周細(xì)胞釋放MMP9［11］，局部亞低溫處理缺血再灌注模型后，TNF-α表達(dá)是否有變化，待于進(jìn)一步研究。金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)可以調(diào)節(jié) MMP9的活性。其中，TIMP-1優(yōu)先與MMP9特異性結(jié)合，形成可溶性非共價(jià)復(fù)合物而發(fā)揮其抑制作用［12］。已有研究［13］證明，缺血后低溫處理可以增加內(nèi)源性TIMPs的水平，表明局部亞低溫處理有可能是通過(guò)增加TIMP-1表達(dá)從而抑制MMP9的活性來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

LN主要由內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成與分泌，與Ⅳ型膠原特定位點(diǎn)結(jié)合形成復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)，維持基底膜正常功能和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，對(duì)BBB的功能和完整性有重要作用［14］。FN廣泛存在于細(xì)胞表面、結(jié)締組織、細(xì)胞外液和大部分的基底膜上，是ECM的重要組成部分。細(xì)胞表面及ECM中的FN分子間通過(guò)二硫鍵相互交聯(lián)，組裝成纖維，維持細(xì)胞和基底膜的功能［15］。FN和LN在基底膜內(nèi)起支持作用，可防止由于靜水壓和滲透壓改變引起的血管變形［3］。MMP9在缺血再灌注損傷早期通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括IV型膠原、LN、FN和內(nèi)皮緊密連接的閉鎖小帶，導(dǎo)致BBB的破壞。正常體溫再灌注4 h組LN和FN表達(dá)較假手術(shù)組顯著減少，而局部亞低溫再灌注4 h組LN和FN表達(dá)較正常體溫再灌注4 h組顯著增加，提示缺血再灌注可以減少LN和FN的表達(dá)，局部亞低溫處理則可在缺血再灌注早期抑制LN和FN降解。局部亞低溫在缺血再灌注早期可抑制MMP9的表達(dá)，表明局部亞低溫處理早期可通過(guò)抑制MMP9表達(dá)，從而抑制其對(duì)LN和FN的降解發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。局部亞低溫再灌注24 h組MMP9表達(dá)也明顯較正常體溫再灌注24 h組下降，而此時(shí)LN和FN表達(dá)與后者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是由于樣本量較少所致誤差，還是二者表達(dá)還受MMP9外其他因素影響，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，局部亞低溫可能通過(guò)抑制缺血再灌注后MMP9的表達(dá)，增加LN和FN的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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