鄭春陽，王 磊，魏國祥，王 巍

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紡織用嗜熱內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶在大腸桿菌中的重組表達(dá)、純化與酶學(xué)性質(zhì)

鄭春陽，王 磊，魏國祥，王 巍

（天津強(qiáng)微特生物科技有限公司, 天津 300384）

首先從Pyrococcus horikoshii中克隆出編碼熱穩(wěn)定性的內(nèi)切纖維素酶基因，以載體pet21a為表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet21a-1171，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plys中進(jìn)行表達(dá)，目的基因得到明顯的可溶性表達(dá)，通過加熱變性處理和離心后，重組酶純度達(dá)到80%以上，隨后對加熱處理后的粗酶液進(jìn)行簡單酶活測定，結(jié)果表明，最適反應(yīng)溫度為95℃，與國外文獻(xiàn)報(bào)道相一致，嗜熱內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重組可溶性表達(dá)。

內(nèi)切葡聚糖酶；超嗜熱古菌；重組表達(dá)

0 引言

當(dāng)前，極端微生物以豐富的代謝類型和生活環(huán)境的多樣性，引起了科學(xué)界和企業(yè)界的極大興趣，由于目前應(yīng)用的酶經(jīng)常在高溫、強(qiáng)堿等極端環(huán)境下易失活，使酶的應(yīng)用受到一定的局限，而極端酶的優(yōu)勢正好彌補(bǔ)了傳統(tǒng)酶的缺陷，因此從嗜極菌中開發(fā)新酶源成為近幾年研究的熱點(diǎn)[1]。

目前，在現(xiàn)有的紡織應(yīng)用領(lǐng)域（例如織物處理、洗滌、柔化、人造絲加工）中，使用傳統(tǒng)的混合型纖維素酶制劑，會對纖維主體結(jié)構(gòu)造成不必要的損傷，較優(yōu)選擇是使用只有內(nèi)切纖維素酶活性的單一組分纖維素酶。而目前市場上所用的只有內(nèi)切纖維素酶活的中性纖維素酶產(chǎn)品主要來源于國外公司，如諾維信、杰能科，由于國外知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)及菌種構(gòu)建的難度，到目前為止，國內(nèi)仍沒有一家企業(yè)能夠生產(chǎn)該類產(chǎn)品。而由于織物處理及生物拋光是一個高溫處理過程，如能開發(fā)出嗜熱只有單一內(nèi)切纖維素酶活性的極端酶制劑，將能更適合用于紡織行業(yè)降解天然結(jié)晶纖維素過程。因此，本研究通過引物設(shè)計(jì)對來自于中已知具有水解結(jié)晶纖維素[2]的能力的內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶進(jìn)行了基因克隆、重組表達(dá)、提取純化等方面的研究,以實(shí)現(xiàn)極端耐熱酶制劑國產(chǎn)化的目的。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3) plys宿主購自于Promega公司，基因組DNA購自美國菌種保藏中心，編號為ATCC700860；質(zhì)粒pET-21a購于Novagen公司。

1.2 酶和試劑

Vent DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；T4 DNA連接酶和DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量等購于TAKARA公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自QIAGEN公司；氨芐青霉素和IPTG購自SIGMA公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

引物由生工生物工程(上海)有限公司合成（見表1）。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.4 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

的PH1171基因片段(第85-1248位堿基)ph1171-sgc的獲得：

以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的體系如下表2所示：

表2 PCR體系

PCR循環(huán)的條件為表3所示：

表3 PCR循環(huán)的條件

去除類SD序列的ph1171-sgc的獲得和重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

首先以ph1171-sgc為模板，分別采用phEG-SG-C-F、Mut-SD-R和Mut-SD-F、phEG-SG-C-R獲得不包含類SD序列的ph1171-sgc的兩個部分，之后采用拼接PCR，獲得了不包含SD序列的ph1171-sgc-mut-sd，該片段經(jīng)Nde I和Not I雙酶切后連入pET21a，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET21-ph1171-sgc-mut-sd。

1.5 phEG-sgc的誘導(dǎo)表達(dá)

phEG-sgc的表達(dá)菌株經(jīng)由pET21-ph1171-sgc-mut-sd轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得，表達(dá)條件為37 ℃，200 r/min，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種時加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，培養(yǎng)至OD= 0.6，再加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)3 h。中間分別于誘導(dǎo)后1.5 h及3 h取樣。4167 r/min離心收集菌體，超聲波破碎（條件：總時間2 min，開2 s，關(guān)2 s，功率50%，冰?。?，取樣80 μL作為全蛋白樣品，余樣再于12000 r/min，4 ℃條件離心10 min，再取80 μL上清作為破菌上清，分別加入20 μL 5×SDS PAGE 上樣緩沖液后加熱處理，12% SDS-PAGE電泳分析得出結(jié)果。

1.6 phEG-sgc的簡單純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

上述菌體經(jīng)超聲破碎后直接置于75 ℃加熱30 min，并于12000 r/min，4 ℃條件下離心30 min后,分別取其上清及沉淀制備電泳樣，采取12%SDS-PAGE電泳分析。然后，再采用加熱離心后的上清作為粗酶液，蛋白含量經(jīng)Bradford法測定標(biāo)準(zhǔn)化后，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為水解底物，采用pH5.6,100 mM醋酸緩沖液,分別于75 ℃，80 ℃，85 ℃，90℃，95 ℃，100 ℃條件下反應(yīng)30 min，分別檢測酶活力及其最適反應(yīng)溫度。酶活力單位定義：1 mg酶蛋白，在pH﹦5.6條件下，每分鐘水解羧甲基纖維素鈉，產(chǎn)生1.0 μg的葡萄糖，即為1個酶活單位，以U/mg表示。其中，葡萄糖濃度采用DNS法[4]檢測。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

的PH1171基因(NCBI基因編號: 1443490)全長1377個堿基，編碼的內(nèi)切葡聚糖酶蛋白全長459個氨基酸，其中第1-84位堿基編碼一個包含28個氨基酸的信號肽。移除1249-1377位堿基編碼的C末端部分殘基不影響內(nèi)切葡聚糖酶的活性，同時能夠顯著提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量[1]，所以我們設(shè)計(jì)引物phEG-SG-C-F和phEG-SG-C-R，以基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得了PH1171基因第85-1248位堿基片段ph1171-sgc（圖1），經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，在1200 bp處得到單一且清晰的DNA條帶，與理論大小相吻合。

圖1 h1171-sgc 基因片段的PCR結(jié)果

LANE M: protein molecular marker; LANE 1: the ph1171-sgc gene fragment

2.2 phEG-sgc的誘導(dǎo)表達(dá)

由圖2我們可以得知，在分子量44 kDa附近有一條蛋白在經(jīng)誘導(dǎo)后得到明顯表達(dá)。且在誘導(dǎo)后0-3 h內(nèi)隨著時間的延長，目的蛋白的表達(dá)量有明顯增加。

圖2 重組phEG-sgc蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖片

LANE M：protein molecular marker; LANE 1:Control of the total protein before induction; LANE 2:total protein after 1.5 h induction; LANE 3: supernatant of the broken cells after 1.5 h induction; LANE 4: total protein after 3 h induction; LANE 5: supernatant of the broken cells after 3h induction

圖3 經(jīng)過熱處理后重組phEG-sgc蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖片

LANE M：protein molecular marker; LANE 1: total protein after induction; LANE 2:supernantant protein after 75℃ heat treatment; LANE 3:precipitant after 75℃ heat treatment.

2.3 蛋白純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

誘導(dǎo)表達(dá)的嗜熱內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶經(jīng)過簡單75 ℃加熱處理后，同樣由圖3可知，溶液中的雜蛋白大多數(shù)均變性沉淀除去，試驗(yàn)證明只要采用簡單的離心或膜過濾就可以得到純度高達(dá)80%以上的酶蛋白。隨后，經(jīng)過75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃下簡單酶活性測定試驗(yàn)，得知該酶在95 ℃具有最大酶解反應(yīng)速度（見圖4），與國外文獻(xiàn)報(bào)道[1]相一致。

3 討論

極端嗜熱菌是一類嗜極端高溫的厭氧真細(xì)菌，雖然產(chǎn)生的酶普遍具有很好的熱穩(wěn)定性及最適反應(yīng)溫度比較高的特點(diǎn)，但也存在著菌體生長條件苛刻，細(xì)胞密度低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的問題?？上驳氖率牵壳叭藗円呀?jīng)利用基因克隆及外源重組表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了外源酶在常溫菌中的表達(dá)，徹底解決了極端酶不易大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)的問題。在本研究中采用同樣技術(shù)成功地實(shí)現(xiàn)了嗜熱內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)，并進(jìn)行了部分純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，但對于pH、金屬離子、染料及表面活性劑等對酶活性的影響，以及Km的測定，由于客觀因素的原因，還沒來得及做更為深入的研究。而且，更為重要的是，關(guān)于極端酶的進(jìn)一步改造開發(fā)及應(yīng)用，必須進(jìn)行高溫生物酶拋光等相關(guān)試驗(yàn)，如采取小型規(guī)模條件下模擬紡織處理工藝，采用織物手感、紋路、光澤、色光變化、強(qiáng)力損失、重量損失及成本等指標(biāo)[3]來綜合評價嗜熱酶用于紡織處理工藝的可行性以及存在的問題，避免盲目開發(fā)及無謂的浪費(fèi)。而且相關(guān)文章表明[1]，今后很有必要在保證酶的催化中心和底物結(jié)合中心不變的情況下，盡可能縮短極端酶的分子量，體積小的改造酶將更容易進(jìn)入長鏈纖維間的縫隙來降解葡聚糖，提高其酶活力及表達(dá)量，使其更加高效地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐。

圖4 重組嗜熱內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

[1] Kashima Y, Mori K, Fukada H, et al. Analysis of the function of a hyperthermophilic endoglucanase from Pyrococcus horikoshii that hydrolyzes crystalline cellulose[J]. Extremophiles, 2005, 9: 37-43.

[2] Ando S, Ishida H, Kosugi Y, et al. Hyperthermostable endoglucanase from Pyrococcus horikoshii[J]. Appl Environ Microbiol, 2002，68: 430-433.

[3] 范學(xué)蘭，牛樂珍. 酸性纖維素酶對棉針織品的整理[J]. 針織工業(yè)，1996,(2):16-22.

[4] 李相前，邵蔚藍(lán). 極耐熱內(nèi)切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 南京師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006,29(3):71-75.

Recombinant Expression, Purification and Enzymatic Properties of the Thermophilic Endo-1, 4-Beta-Glucanase In

ZHENG Chun-yang, WANG Lei, WEI Guo-xiang, WANG Wei

(Tianjin Robustnique Corporation Ltd., Tianjin 300084, China)

Firstly,the endo-1, 4-beta-glucanase genes fromwascloned followed by the construction of the recombinant plasmidpet21a-1171. Then the recombinant plasmid was transformed intoBL21 (DE3) plys, which showed the obvioussoluble expression. Thepurityoftherecombinant enzymehasreachedmore than 80% byheatdenaturation treatmentand centrifugation. A simpleenzymatic assaysshowed that the optimalreaction temperature is 95℃. The expression of recombinant soluble thermophilic endo-1, 4-beta-glucanase has been successfully established.

Endoglucanase; Hyperthermophilic Archaeon; Recombinant Expression

Q939.97

A

2095－414X(2013)03－0031－04

鄭春陽（1976-），男，博士，副高級工程師，研究方向：極端工業(yè)酶制劑.

天津市濱海新區(qū)科技小巨人成長計(jì)劃-科技型企業(yè)創(chuàng)新發(fā)展（科技創(chuàng)業(yè)）項(xiàng)目(2010-BK130070)，科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(11C26211203970)，天津市濱海新區(qū)重大科技項(xiàng)目(2011-BK120014)，天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12ZCZDSY01800).