胡圣大, 馬根山, 姚玉宇, 陳中璞, 嚴(yán)鳳娣

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院心內(nèi)科, 江蘇 南京 210009)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

人心肌干細(xì)胞的體外改良培養(yǎng)*

胡圣大, 馬根山△, 姚玉宇, 陳中璞, 嚴(yán)鳳娣

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院心內(nèi)科, 江蘇 南京 210009)

目的用改良的培養(yǎng)基培養(yǎng)人心肌干細(xì)胞，并篩選鑒定。方法通過心臟外科手術(shù)取下右心耳組織，用組織塊培養(yǎng)法來獲得原代心肌干細(xì)胞，用改良的心肌干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，增殖傳代后進(jìn)行心肌干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定，再用免疫磁珠篩選以獲得較純的目的心肌干細(xì)胞。結(jié)果培養(yǎng)約2周后，貼壁良好的心肌組織塊周圍可見有小、圓、亮的細(xì)胞爬出，用Accutase(細(xì)胞消化液)短時(shí)間消化后沖洗細(xì)胞，培養(yǎng)增殖傳代，其增殖能力與傳統(tǒng)心肌干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞比較無顯著差異，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定c-Kit(干細(xì)胞表面標(biāo)志物)，其陽性率(6.8±2.1)%，之后用含抗c-Kit抗體(anti-c-Kit)的磁珠進(jìn)行分選，即得較純的c-Kit陽性(c-Kit+)心肌干細(xì)胞,它們可以分化為心肌細(xì)胞。結(jié)論通過心臟組織塊貼壁培養(yǎng)法，用改良后的心肌干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，再借助免疫磁珠的分選，同樣可得到較純的c-Kit+心肌干細(xì)胞。

心肌干細(xì)胞； 流式細(xì)胞術(shù)； 磁珠分選

一直以來的傳統(tǒng)觀念都認(rèn)為哺乳動(dòng)物的心臟是終末分化器官，心肌細(xì)胞是永久性細(xì)胞(正常情況下心肌細(xì)胞的壽命與個(gè)體壽命相同，不能分裂增殖)。伴隨著疾病和衰老，部分成年心肌細(xì)胞丟失，只能通過剩余心肌細(xì)胞的肥大和結(jié)締組織的增生纖維化來進(jìn)行重構(gòu)代償。然而，近年來這一觀點(diǎn)正逐漸被動(dòng)搖，認(rèn)為成年心臟雖是終末器官，但心肌組織中含有可以再生的細(xì)胞，稱之為心肌干細(xì)胞，它可以分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞[1]。在人的一生中，成年心肌細(xì)胞不停地衰老死亡，同時(shí)由心肌干細(xì)胞不斷增殖分化為新的心肌細(xì)胞，維持心肌細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)平衡，保持心臟功能[2-3]。

病理情況下心肌細(xì)胞的丟失量超過其增殖代償能力，便會(huì)出現(xiàn)前述傳統(tǒng)觀念的變化，因此如何進(jìn)一步促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖歸巢分化便成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。而這些研究的基礎(chǔ)在于心肌干細(xì)胞的培養(yǎng)獲得，本研究旨在探索一條簡便實(shí)用的培養(yǎng)方法，為心肌干細(xì)胞的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

Trypsin和collagenaseⅣ粉劑購自Biosharp;Accutase購自Millipore;無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素鏈霉素雙抗、IMDM和DMEM/F12培養(yǎng)液均購自HyClone;β-巰基乙醇購自Sunshine;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自Sigma;anti-c-Kit microbeads和anti-c-Kit-PE購自Miltenyi Biotec；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo；恒溫振蕩儀購自太倉市科教器材廠。

2方法

2.1取材和培養(yǎng) 心臟外科手術(shù)過程中(患者年齡2～72歲；心臟疾病有：冠心病、瓣膜病和先心病)，在情況許可的條件下，取右心耳組織數(shù)克。用不含鈣、鎂的無菌PBS沖洗掉血液，去掉脂肪組織后剪成大小1 mm×1 mm ×1 mm 左右的小塊，然后移入離心管加入適量0.2%胰蛋白酶和0.1%膠原酶IV的混合液，37 ℃振蕩消化5 min，移去消化液，重復(fù)3次。處理后的組織塊用完全組織塊培養(yǎng)液(complete explant medium，CEM;以IMDM為基礎(chǔ)，含20%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和0.1 mmol/L β-巰基乙醇)沖洗1～2次后移入到6孔板中并使其均勻分散。加入少量CEM(約0.5 mL左右)，保持組織塊濕潤即可，置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中貼壁。8～12 h后加入1～1.5 mL的CEM，繼續(xù)前述條件培養(yǎng)，2～3 d換1次培養(yǎng)液。

2.2心肌干細(xì)胞的收集培養(yǎng) 通常3～7 d的時(shí)間內(nèi)，貼壁良好的心肌組織塊周圍可見到先有長梭形的成纖維細(xì)胞爬出，之后數(shù)天即可見在其上面爬出的小、圓、亮的細(xì)胞，當(dāng)有較多的此類細(xì)胞時(shí)，即用Accutase消化(約2 min即可)，之后加入少量改良的心肌干細(xì)胞培養(yǎng)液(improved cardiosphere-growing medium，improved CGM;以DMEM/F12為基礎(chǔ),含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和0.1 mmol/L β-巰基乙醇，較之傳統(tǒng)的CGM，減少了VEGF和bFGF 2種細(xì)胞因子)，輕柔地沖洗數(shù)次，將沖洗后的混合液移入6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)傳代增殖，2～3 d換1次培養(yǎng)液。

2.3心肌干細(xì)胞的鑒定及純化 待3～6 d后，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞基本上生長融合，且為單層細(xì)胞，用Accutase消化3～5 min，取適量樣品，加入anti-c-Kit-PE孵育后行流式細(xì)胞術(shù)分析，剩余細(xì)胞用anti-c-Kit抗體吸附的磁珠進(jìn)行分選[4-5]，即可得到較多較純的c-Kit+心肌干細(xì)胞。

2.4心肌干細(xì)胞的增殖和分化測定 利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)來測定細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞接種于96孔板，每孔約3×103細(xì)胞，分別用傳統(tǒng)的CGM和不含VEGF和bFGF的CGM進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后各16個(gè)孔在450 nm處測定A值，所得數(shù)據(jù)間接表示細(xì)胞的量，所有步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。開胸結(jié)扎前降支制作裸鼠心梗模型后，經(jīng)心外膜注射心肌干細(xì)胞，4周后取心肌組織進(jìn)行組織免疫熒光染色鑒定心肌干細(xì)胞的分化情況。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1組織塊的培養(yǎng)

貼壁好的組織塊周圍，早的3 d后即可看見周圍有梭形的成纖維細(xì)胞爬出，最晚的1周左右也可以爬出，否則通常不再會(huì)有細(xì)胞爬出。成纖維細(xì)胞爬出后3 d左右在其上面即可以出現(xiàn)小、圓、亮的細(xì)胞，以后逐漸增多,見圖1。

Figure 1. Primary cardiac stem cells cultured from tissue blocks (×100). Lower left corner: myocardial tissue blocks.The arrows show small, round and bright primary cardiac stem cells,while the triangles refer to the fibroblasts.

圖1組織塊培養(yǎng)的原代心肌干細(xì)胞

2心肌干細(xì)胞的獲得、培養(yǎng)及純化鑒定

待小、圓、亮的細(xì)胞出現(xiàn)較多后即可消化沖洗下來移入培養(yǎng)皿培養(yǎng)增殖，此時(shí)部分心肌干細(xì)胞貼壁后空間不受約束，胞質(zhì)會(huì)向外伸展而形成梭形、多邊形或不規(guī)則異形等形狀,見圖2。不同年齡及疾病患者細(xì)胞的c-Kit陽性率是不一樣的，總體上未分選細(xì)胞c-Kit的陽性率約2%～18%(6.8%±2.1%),見圖3。經(jīng)磁珠分選后即可得到一定量的較純的c-Kit+心肌干細(xì)胞，c-Kit陽性率可超過80%。所得細(xì)胞可于-80 ℃較長時(shí)間保存(更長時(shí)間保存應(yīng)保存于液氮中)，且復(fù)蘇后仍具有干細(xì)胞活力。

3心肌干細(xì)胞的增殖和分化

利用CCK-8法我們測定了細(xì)胞的增殖能力，均直接用A值表示細(xì)胞的量，傳統(tǒng)CGM培養(yǎng)組和不含VEGF及bFGF的CGM組A值分別是0.156±0.013和0.149±0.011，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。體內(nèi)心肌干細(xì)胞的分化實(shí)驗(yàn)明確其可以分化為心肌細(xì)胞,見圖4。

Figure 2. The second generation of cardiac stem cells (×200).

圖2傳至第2代的呈球形的心肌干細(xì)胞

Figure 3. Flow cytometric identification of cardiac stem cells.A: control; B: labeled with anti-c-Kit-PE flow cytometry antibody and the c-Kit positive rate was 8.44%.

圖3消化下的第2代心肌干細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)鑒定

Figure 4. Identification of the differentiation of cardiac stem cells using tissue immunofluorescence technique (×200). Red fluorescence shows staining of myocyte cytoplasm by sarcomeric α-actin antibody; blue fluorescence shows nuclei; green fluorescence shows localization of mitochondria.

圖4心肌干細(xì)胞的分化鑒定

討 論

常用于鑒定心肌干細(xì)胞的表面標(biāo)記有c-Kit、isl1和Sca-1等[6-8]，本實(shí)驗(yàn)室測得Sca-1陽性的細(xì)胞數(shù)比例僅1.4%(由于市面上暫無用于測人干細(xì)胞的Sca-1，考慮到可能的交叉反應(yīng)，遂試用抗小鼠的anti-Sca-1，同時(shí)測得小鼠心肌干細(xì)胞的Sca-1陽性率1.8%，較之人無顯著差異)。而用anti-isl1則幾乎無陽性表達(dá)，加之文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為從人心肌組織中分離的c-Kit+細(xì)胞即為心肌干細(xì)胞[6]，故我們實(shí)驗(yàn)室最終確定選定c-Kit為心肌干細(xì)胞的待測表面標(biāo)志。

本研究采用Messina等[9]的組織塊培養(yǎng)法獲取原代細(xì)胞，該方法避免了長時(shí)間多次酶消化對細(xì)胞造成的損傷，在大大減少了雜細(xì)胞的同時(shí)也最大限度地使用了心肌組織塊，可以反復(fù)多次地從組織塊周圍消化下所需的細(xì)胞。對于小、圓、亮的細(xì)胞采用Accutase短時(shí)間消化后用改良的CGM輕柔沖洗2～3次，用力較大則會(huì)將組織塊沖下，其獲取細(xì)胞的效率比Tang等[10]報(bào)道的D-Hanks液沖洗法要高很多，而且Accutase作用較溫和，對所得細(xì)胞的活性及表面標(biāo)志影響均不大，c-Kit的陽性率與國外文獻(xiàn)報(bào)道的一致[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期的細(xì)胞培養(yǎng)液CGM中均加入了EGF和bFGF，在本研究的細(xì)胞培養(yǎng)中，我們嘗試著使用未加EGF和bFGF的改良CGM，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖活力在通常情況下并沒有發(fā)生明顯的改變，用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿3～6 d即需傳代分瓶，之后的流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定c-Kit的陽性率沒有明顯的差異[1]。

實(shí)驗(yàn)中還有幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：首先是組織塊的初次加液量與貼壁時(shí)間的掌握，時(shí)間短加液過多均導(dǎo)致組織塊未貼壁好，細(xì)胞無法爬出，時(shí)間久加液少，培養(yǎng)液干涸組織塊細(xì)胞死亡；其次是初次消化細(xì)胞時(shí)間的掌握，過短細(xì)胞消化不下來，過久會(huì)消化下貼壁較牢的成纖維細(xì)胞，致使雜細(xì)胞過多，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)增加工作量，甚至影響心肌干細(xì)胞的增殖分化。由于所得原代細(xì)胞數(shù)量較少(若是單用D-Hanks沖洗，所得細(xì)胞數(shù)量更少)，若直接用磁珠分選細(xì)胞，首先會(huì)浪費(fèi)磁柱的利用率；其次加之操作過程中丟失及破壞的細(xì)胞，最后所得目的細(xì)胞已所剩無幾。故而本實(shí)驗(yàn)室在取得原代細(xì)胞后，先經(jīng)3～6 d的增殖后再進(jìn)行磁珠分選，得到目的細(xì)胞的數(shù)量大大增加。

總之，本實(shí)驗(yàn)室采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，成功地獲得原代心肌干細(xì)胞后，未加EGF和bFGF的改良細(xì)胞培養(yǎng)液也成功地運(yùn)用于心肌干細(xì)胞的培養(yǎng)，這種改良的細(xì)胞培養(yǎng)液對干細(xì)胞的增殖分化能力及c-Kit的表達(dá)未產(chǎn)生明顯的影響，但卻大大減少了細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。培養(yǎng)獲得的心肌干細(xì)胞可用于進(jìn)一步的研究，以期最終能夠解決臨床問題。

(致謝:感謝東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院心胸外科劉志勇教授和何偉博士提供的人心肌組織塊！)

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Cultureofhumancardiacstemcellswithimprovedcardiosphere-growingmediuminvitro

HU Sheng-da, MA Gen-shan, YAO Yu-yu, CHEN Zhong-pu, YAN Feng-di

(DepartmentofCardiology,theAffiliatedZhongdaHospitalofSoutheastUniversity,Nanjing210009,China.E-mail:magenshan@hotmail.com)

AIM: To prepare an improved medium for culturing human cardiac stem cells.METHODSThe heart samples of the right auricle obtained from the patients after cardiac surgery were minced into pieces (about 1 mm×1 mm×1 mm), digested and cultured. The primary cells obtained were cultured with improved cardiosphere-growing medium (CGM) for proliferation, and the cells were identified by flow cytometry. Finally, purer c-kit+cells were obtained by the method of magnetic bead sorting.RESULTSAfter about 2 weeks of culture, small, round and phase-bright cells migrated from the well-adherent explants over a layer of fibroblast-like cells. These cells were collected by a brief digestion with Accutase, washed and cultured with improved CGM. No significant difference of the proliferative capacity between using traditional CGM and improved CGM was observed. After subculture and proliferation, the identification result by flow cytometry showed that the positive rate of c-Kit surface marker on these cells was (6.8±2.1)%. By the method of anti-c-Kit magnetic bead sorting, purer c-Kit+cardiac stem cells were obtained and differentiated into cardiomyocytes.CONCLUSIONPurer c-Kit+cardiac stem cells are isolated with the improved CGM culture.

Cardiac stem cells; Flow cytometry; Magnetic bead sorting

R542.2+2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.035

1000- 4718(2013)02- 0381- 04

2012-07-03

2012-12-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.6590000029)

△通訊作者Tel： 025-83272038； E-mail: magenshan@hotmail.com