李 巖, 馬明明, 張小強, 潘雯菲, 劉向勇, 王曉芝△
(1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科,山東 濱州 256603; 2德州市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,山東 德州 253014; 3濱州醫(yī)學院細胞生物學教研室,山東 煙臺 264003)
血管生成素4對脂多糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的影響*
李 巖1, 馬明明1, 張小強2, 潘雯菲3, 劉向勇3, 王曉芝1△
(1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科,山東 濱州 256603;2德州市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,山東 德州 253014;3濱州醫(yī)學院細胞生物學教研室,山東 煙臺 264003)
目的觀察血管生成素4(Ang-4)對脂多糖(LPS)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷的影響,并探討其可能的作用機制。方法EnVision法免疫組化鑒定HUVECs。LPS誘導細胞損傷,不同劑量的Ang-4干預。顯微鏡下觀察細胞形態(tài),MTT法檢測細胞活力,ELISA法檢測von Willebrand因子(vWF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)含量,real-time PCR檢測Toll樣受體4(TLR4)、核因子κB(NF-κB) p65和TNF-α mRNA含量變化。結果免疫組化示胞漿內人Ⅷ因子相關抗原呈陽性;與正常組比,LPS組細胞增殖活力降低(P<0.01),vWF及TNF-α分泌增多(P<0.01),且TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表達升高(P<0.01);Ang-4(100 μg/L)組可恢復細胞活力,降低vWF及TNF-α含量(P<0.01),抑制LPS所致TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA的表達(P<0.01)。結論Ang-4可拮抗LPS誘導的HUVECs損傷,這可能與抑制TLR4-NF-κB p65-TNF-α信號通路的活化有關。
血管生成素4; 脂多糖類; 人臍靜脈內皮細胞; von Willebrand因子
急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種急性低氧性呼吸功能不全,進一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ALI/ARDS發(fā)病機制復雜,病死率高達50%。目前認為持續(xù)的內皮細胞激活并受損、血管高通透性及血管滲漏是ALI/ARDS發(fā)病的關鍵。血管生成素(angiopoietin,Ang)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的由血管內皮周圍細胞分泌的一種通過作用于細胞膜上的酪氨酸激酶受體Tie-2發(fā)揮生物學作用的內皮細胞特異性促血管生成因子。Ang-4是Valenzuela等[1]發(fā)現(xiàn)的人胎盤分離到的一種分泌蛋白。本文旨在探索Ang-4對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷的影響及其可能的作用機制。
1材料
HUVECs由本實驗室提供;Ang-4購自R&D;鼠抗人Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體及Ⅱ抗羊抗鼠IgG H&L均購自Abcam; LPS購自Sigma;檢測von Willeband因子(von Willebrand factor,vWF)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的ELISA試劑盒購自上海太陽生物有限公司;real-time PCR引物均由上海生工生物有限公司設計。
2方法
2.1HUVECs培養(yǎng) HUVECs用含雙抗及含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),待細胞長到80%融合時傳代。
2.2HUVECs形態(tài)學觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長特征。人Ⅷ因子相關抗原鑒定采用EnVision法,以胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表現(xiàn)。
2.3實驗分組及處理 (1)對照組:不加任何處理因素;(2)LPS組:加入LPS(10 mg/L);(3)Ang-4組: Ang-4(10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L)預處理0.5 h,加入LPS 10 mg/L共培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下拍照。
2.4MTT法檢測LPS及Ang-4對細胞增殖活力的影響 參照說明書操作。細胞抑制率(%)=1-實驗組A492/對照組A492×100%。
2.5ELISA法檢測vWF及TNF-α含量 將細胞接種于24孔板,設正常對照組、10 mg/L LPS刺激組和100 μg/L Ang-4干預組,培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液及細胞裂解液。按ELISA試劑盒說明書操作。
2.6Real-time PCR檢測Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) p65和TNF-α mRNA含量變化 采用Trizol法抽提細胞總RNA,SYBR Green法進行real-time PCR。TNF-α上游引物 5’-TAGCCCATGTTGTAGCAAACC-3’,下游引物5’-ATGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3’;NF-κB p65上游引物5’-GGAGCACAGATACCACCAAGA-3’,下游引物5’-CGCTTCTTCACACACTGGAT-3’;TLR4上游引物5’-TGTCCCTGAACCCTATGAACTT-3’,下游引物5’-CTTCTAAACCAGCCAGACCTTG-3’;GAPDH上游引物5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,下游引物5’-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’。每個樣品重復3次,與內參照均一化消除誤差后取平均值,用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。
3統(tǒng)計學處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用SPSS 11.0軟件分析,多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗,組間兩兩比較采用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
1Ⅷ因子相關抗原鑒定
免疫組化染色可見細胞呈梭形或多邊形,胞漿豐富,胞漿內可見棕黃色染色顆粒,證實細胞為人臍靜脈內皮細胞,見圖1。
Figure 1. The expression of factor Ⅷ in HUVECs detected by immunohistochemistry (×200).
圖1免疫組化法檢測HUVECs內人Ⅷ因子相關抗原
2Ang-4對LPS誘導的HUVECs活力的影響
與正常組比較,LPS組細胞活力明顯受抑制(P<0.01);與LPS組比較 ,Ang-4(10 μg/L、20 μg/L和50 μg/L)組細胞活力無明顯變化,Ang-4(100 μg/L和200 μg/L)組活力明顯增強(P<0.01),Ang-4(100 μg/L)組和Ang-4(200 μg/L)組比較細胞活力無明顯變化,見表1,說明一定濃度的Ang-4對LPS誘導的HUVECs損傷有一定的保護作用,可改善細胞活力。
表1各組細胞活力的比較
Table 1. Comparison of cell viability among groups (Mean±SD.n=6)
GroupAInhibitoryrateControl0.699±0.0100LPS0.418±0.007*40.20%*LPS+Ang-4(10μg/L)0.421±0.005*39.77%*LPS+Ang-4(20μg/L)0.422±0.006*39.63%*LPS+Ang-4(50μg/L)0.425±0.006*39.20%*LPS+Ang-4(100μg/L)0.473±0.007*△32.33%*△LPS+Ang-4(200μg/L)0.481±0.006*△31.19%*△
*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group.
3Ang-4對人臍靜脈內皮細胞形態(tài)的影響
如圖2所示,正常組(A)細胞胞漿豐富,細胞間連接緊密,邊界清楚,呈單層鋪路石狀排列,細胞呈多角形、梭形或卵圓形;LPS組(B)細胞變圓縮,胞體變小,細胞間隙增寬,邊界模糊;Ang-4(100 μg/L)組(C)較模型組細胞生長狀態(tài)好,邊界較清楚。
4Ang-4對LPS誘導HUVCEs損傷釋放的vWF及TNF-α含量的影響
LPS組比正常組vWF含量明顯增高(P<0.01),Ang-4組與LPS組比較,vWF含量明顯降低(P<0.01);在細胞內,結果反之,見表2,表明Ang-4可減輕LPS誘導的內皮細胞功能障礙,減少vWF胞內釋放。LPS組上清液TNF-α含量比正常組顯著升高(P<0.01),Ang-4組與LPS組比較,TNF-α含量明顯降低(P<0.01),見表2,表明Ang-4可一定程度上降低TNF-α的表達而減輕LPS所致細胞炎癥反應。
Figure 2. Cell morphology observed under an inverted microscope (×100).A: control group; B: LPS group; C: LPS+Ang-4 (100 μg/L) group.
圖2細胞倒置顯微鏡觀察Ang-4對細胞形態(tài)的影響
表2 各組細胞中vWF及TNF-α含量比較
*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group.
5Real-timePCR測TLR4、NF-κBp65和TNF-αmRNA含量變化
與正常組相比,模型組TLR4、NF-κB p65和TNF-α mRNA表達升高(P<0.01);與模型組相比,Ang-4(100 μg/L)組三者含量顯著降低(P<0.01),見表3,表明Ang-4預處理可能抑制了LPS誘導的TLR4-NF-κB p65-TNF-α信號通路激活。
肺血管內皮細胞是ALI/ARDS重要的靶細胞和效應細胞, LPS是TLR信號途徑的配基,能特異性地與內皮細胞膜上的TLR4結合,激活NF-κB轉錄因子,促進一系列炎癥蛋白的表達[2]。以內皮細胞作為新的治療靶點,干預內皮屏障破壞所致的血管損傷有可能為治療ALI/ARDS提供新思路。
表3 各組細胞real-time PCR結果
*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group.
國內外有關Ang-4生物學效應的研究較少,尚無統(tǒng)一定論。Ang-4可抑制人類小細胞肺癌的血管生成及改善血管高滲透狀態(tài),抑制細胞增殖;而Brunckhorst等[3]發(fā)現(xiàn),Ang-4可以通過激活細胞外細胞信號調節(jié)激酶促進多形性惡性膠質瘤細胞增殖。Olsen等[4]證實,Ang-4可抑制由堿性成纖維細胞生長因子及血管內皮生長因子誘導的內皮細胞遷移;而Lee研究發(fā)現(xiàn),Ang-4重組蛋白可顯著促進內皮細胞絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化而激動Tie-2,促進內皮細胞的遷移、成熟。Yamakawa等[5]研究示,Ang-4表達上調可減輕新生的毛細血管滲漏、組織水腫及炎癥,也證明了Ang-4在血管發(fā)生后起到穩(wěn)定血管結構、減輕炎癥的作用。
本實驗應用10 mg/L LPS刺激HUVECs,不同濃度的Ang-4干預。結果發(fā)現(xiàn),LPS處理可誘導一系列細胞損傷表現(xiàn),而Ang-4(100 μg/L)組可拮抗LPS誘導的損傷效應。有研究[6]表明,LPS通過與內皮細胞表面的TLR4結合,激活NF-κB信號通路,促進NF-κB核內轉移,啟動靶基因的轉錄和表達,誘導炎癥因子TNF-α等釋放,損害內皮細胞并致其通透性增加、功能障礙。vWF可作為內皮激活、受損、滲漏性損傷和功能障礙的標志物[7]。本實驗血清v-WF濃度升高即可表征內皮細胞功能障礙。Ang-4對LPS引起的HUVECs損傷有保護作用,可能與Ang-4抑制LPS誘導TLR4-NF-κBp65-TNF-α信號通路的活化有關,而Ang-4具體在哪個環(huán)節(jié)阻斷了信號通路尚未得知,后續(xù)實驗會深入研究。Wang等[8]研究表明,LPS刺激HUVECs損傷與TLR4及其下游信號轉導通路元件髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、Toll樣受體相關的干擾素活因化子(Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-β,TRIF)有關,而MyD88與TRIF是NF-κB上游重要的信號分子;有研究顯示LPS刺激可引起TLR4、MyD88、TRIF mRNA高表達,故Ang-4改善LPS的損傷效應,可能與抑制LPS-TLR4-MyD88/TRIF-NF-κB p65-TNF-α信號通路有關。
綜上所述,Ang-4可拮抗LPS誘導的HUVECs損傷,有一定的血管保護及抗炎作用,其機制可能與抑制LPS誘導TLR4-NF-κB p65-TNF-α信號通路活化有關。本研究為全面揭示ALI/ARDS的發(fā)病機制提供了新的實驗依據(jù)。
[1] Valenzuela DM,Griffiths JA,Rojas J,et al.Angiopoietin 3 and 4:diverging gene counterparts in mice and humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(5):1904-1909.
[2] Lu Y, Yeh W, Ohashi P. LPS/TLR4 signal transduction pathway[J].Cytokine,2008,42(2):145-151.
[3] Brunckhorst MK,Wang H,Lu R,et al.Angiopoietin-4 promotes glioblastoma progression by enhancing tumor cell viability and angiogenesis[J].Cancer Res,2010,70(18):7283-7293.
[4] Olsen WB,Ley CD,Junker N,et al.Angiopoietin-4 inhibits angiogenesis and reduce interstitial fluid pressure[J].Neoplasia,2006,8(5):364-372.
[5] Yamakawa M, Liu LX, Date T, et al. Hypoxia-inducible factor-1 mediates activation of cultured vascular endothelial cells by inducing multiple angiogenic factors[J]. Circ Res, 2003, 93(7):664-673.
[7] Mendolicchio GL, Ruggeri ZM.New perspectives on von Willebrand factor functions in hemostasis and thrombosis[J].Semin Hematol,2005,42(1):5-14.
[8] Wang W, Deng M, Liu X, et al. TLR4 activation induces nontolerant inflammatory response in endothelial cells[J].Inflammation,2011,34(6):509-518.
Effectsofangiopoietin4onlipopolysaccharide-inducedinjuryofhumanumbilicalveinendothelialcells
LI Yan1, MA Ming-ming1, ZHANG Xiao-qiang2, PAN Wen-fei3, LIU Xiang-yong3, WANG Xiao-zhi1
(1DepartmentofIntensiveCareUnit,AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256603,China;2DepartmentofIntensiveCareUnit,DezhouPeople'sHospital,Dezhou253014,China;3DepartmentofCellBiology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:hxicuwxz@163.com)
AIM: To observe the effects of angiopoietin 4 (Ang-4) on lipopolysaccharide (LPS)-induced injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe EnVision immunohistochemical method was used to identify the HUVECs. After pre-treated with different doses of Ang-4 for 0.5 h, HUVECs was exposed to LPS at concentration of 10 mg/L for 24 h. The cell viability was evaluated by MTT assay. The content of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in the supernatant and the concentrations of intracellular and supernatant von Willebrand factor (vWF) were detected by ELISA. The mRNA levels of Toll-like receptor 4 (TLR4), NF-κB p65 and TNF-α were determined by real-time PCR.RESULTSFactor Ⅷ in the cytoplasm was positive in the HUVECs.Compared with normal group, LPS reduced the cell viability (P<0.01), and significantly increased the secretion of TNF-α and vWF (P<0.01). The mRNA expression of TLR4, NF-κB p65 and TNF-α also increased (P<0.01). Ang-4 at concentration of 100 μg/L enhanced the cell viability (P<0.01), reduced the content of vWF and TNF-α, and inhibited the LPS-induced increases in the mRNA levels of TLR4, NF-κB p65 and TNF-α (P<0.01).CONCLUSIONAng-4 antagonizes LPS-induced damage in HUVECs by inhibiting TLR4-NF-κB p65-TNF-α signaling pathways.
Angiopoietin 4; Lipopolysaccharides; Human umbilical vein endothelial cells; von Willebrand factor
R363.2
A
10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.031
1000- 4718(2013)11- 2088- 04
2013- 04- 21
2013-09 - 16
山東省自然科學基金資助項目(No.Y2008C163);泰山學者建設工程資助項目; 濱州醫(yī)學院學科帶頭人與學術骨干支持計劃資助項目(No.510906)
△通訊作者 Tel: 0543-3256795; E-mail: hxicuwxz@163.com