畢 涌， 洪 娟， 李力群， 李曉莉， 魏 鵬， 施鎮(zhèn)江， 王廷華， 張 旭

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1神經(jīng)生物學(xué)重點學(xué)科， 2附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000；3昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，云南 昆明 650031)

·短篇論著·

重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)活性的研究*

畢 涌1,2， 洪 娟1， 李力群1， 李曉莉1,2， 魏 鵬3， 施鎮(zhèn)江3， 王廷華3， 張 旭1,2

(溫州醫(yī)科大學(xué)1神經(jīng)生物學(xué)重點學(xué)科，2附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000；3昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，云南 昆明 650031)

目的構(gòu)建人神經(jīng)生長因子β亞基(β-NGF)真核表達載體，轉(zhuǎn)染熒光小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)并研究其生物學(xué)活性。方法全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)和純化熒光小鼠MSCs，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3-β-NGF，并轉(zhuǎn)染MSCs；免疫組織化學(xué)染色檢測β-NGF的表達，觀察β-NGF陽性的MSCs對小鼠海馬神經(jīng)元生長的作用。結(jié)果熒光小鼠MSCs可發(fā)出明亮的綠色熒光，且熒光不隨培養(yǎng)時間延長和傳代次數(shù)增加而衰減。重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后β-NGF陽性率為(37.12±2.14)%，高于MSCs組[(2.36±0.62)%]和空白對照組[(1.43±0.76)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs上清液培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元的突起長度[(31±3)μm]較pcDNA3轉(zhuǎn)染MSCs組[(23±4)μm]明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明β-NGF基因轉(zhuǎn)染MSCs培養(yǎng)上清液中的產(chǎn)物能促進小鼠海馬神經(jīng)元的突起生長，具有明顯的生物學(xué)活性。結(jié)論成功構(gòu)建了pcDNA3-β-NGF真核表達載體，其轉(zhuǎn)染的熒光小鼠MSCs能正確、穩(wěn)定表達和分泌有生物學(xué)活性的β-NGF。

神經(jīng)生長因子； 間充質(zhì)干細胞； 基因轉(zhuǎn)染

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有免疫原性弱、體外基因轉(zhuǎn)染率高、能穩(wěn)定高效表達外源基因等優(yōu)點，是作為細胞和基因治療種子細胞的理想選擇[5]。然而，干細胞移植后在體內(nèi)的遷移、定植、分布和分化等有賴于對干細胞的示蹤和定量技術(shù)。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs能穩(wěn)定表達GFP，是MSCs研究中良好的示蹤工具[6]。β亞單位是NGF完整的生物活性單位，分子量較小，相對于完整的NGF分子則較易透過血腦屏障。因此，本研究將構(gòu)建人β-NGF真核細胞表達載體并轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs，觀察β-NGF的表達及其對小鼠海馬神經(jīng)元的影響，為β-NGF的基因治療探索一種新的方法。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自HyClone。TRIzol RNA提取試劑盒、G418和β-NGF抗體購Sigma；IPTG、X-Gal、One Step RNA PCR Kit(AMV)、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindIII及XhoI、DNA凝膠純化試劑盒和DNA marker(DL2000和λ-EcoT14 I digest)購自TaKaRa；DH5α大腸桿菌由本實驗室保存；pcDNA3載體購自Invitrogen；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Gibco；二步法免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。超凈工作臺;25 cm2培養(yǎng)瓶(HyClone);SHEL LAB TC2323 CO2Incubator;Leica DM IRB熒光顯微鏡;Olympus倒置相差顯微鏡。

2方法

2.1GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定 GFP轉(zhuǎn)基因小鼠由昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供。參照Phinney等[7]方法，脫頸法處死GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，分離雙側(cè)脛股骨中全骨髓，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取MSCs。按1×109/L接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12混合培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后首次全量換液，此后每隔3 d全量換液。當(dāng)細胞貼壁達90%融合時即可進行傳代。采用CD44、CD45和CD54抗體進行免疫組織化學(xué)染色，通過DAB顯色后光鏡下觀察并計算陽性細胞的百分比進行鑒定。

2.2真核表達載體pcDNA3-β-NGF的構(gòu)建及鑒定

溫室栽培番茄育苗管理的關(guān)鍵時期，此時期如果管理不當(dāng)，會對幼苗生產(chǎn)造成很大影響，稍有疏忽就會造成嚴重的經(jīng)濟損失。那么應(yīng)注意哪些問題呢？

2.2.1引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的人β-NGFcDNA(No. X52599)序列設(shè)計PCR引物。上游引物為5’-CGAAGCTTAGCGTAATGTCCATGTTG-3’，下游引物為5’- GCCTCGAGGGCAGGTCAGGCTCTTCT-3’，下劃線為HindIII和XhoI的酶切位點。

2.2.2RNA的提取和RT-PCR反應(yīng)擴增目的基因 取本實驗室保存的人腦瘤旁組織約50 mg，按TRIzol RNA提取試劑盒操作說明提取RNA，甲醛變性凝膠電泳檢測其完整性。取RNA 1 μg，濃度為20 μmol/L的上、下游引物各1 μL，參考TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說明，按下列條件在PCR自動擴增儀上進行RT-PCR。50 ℃、30 min變性，94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR反應(yīng)結(jié)果，用DNA凝膠純化試劑盒提取目的DNA的PCR產(chǎn)物。

2.2.3構(gòu)建pcDNA3-β-NGF質(zhì)粒并鑒定 RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物目的DNA片段和pcDNA3分別進行HindIII和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并線性化載體，用DNA凝膠純化試劑盒回收酶切DNA片段。酶切后的pcDNA3線性質(zhì)粒和目的DNA片段以T4DNA連接酶建立連接反應(yīng)，16 ℃連接20 h。取連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種在含有X-Gal和IPTG并帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上，倒置培養(yǎng)12～16 h。根據(jù)藍白斑進行篩選，取陽性克隆(白斑)用SDS堿裂解法提取質(zhì)粒。HindIII和XhoI雙酶切鑒定重組體及其插入方向，并送測序鑒定。

2.3重組pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs 用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將MSCs輕柔吹打成密度為1×109/L的細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)后用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前全量換液1次。將MSCs以1×105/well的密度接種在24孔板中，分別加入不同濃度的G418培養(yǎng)基各1 mL置于37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)并觀察細胞生長情況，確定抑制細胞生長的最低G418濃度。

按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的操作說明書，分別取純化的pcDNA3-β-NGF及空載體pcDNA3各4 μg，溶于100 μL DMEM/F12培養(yǎng)液中；加入LipofectamineTM2000和DMEM/F12培養(yǎng)液，室溫放置15 min后加入0.8 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于37℃、50%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后72～96 h，待細胞生長至接近融合時，收集各組細胞的上清凍存?zhèn)溆?，細胞傳代培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達培養(yǎng)皿底面積的60%～70%時，棄去培養(yǎng)液，更換含濃度為700 mg/L(參照最小致死濃度為600 mg/L的測定結(jié)果)的G418培養(yǎng)液進行篩選，對篩選形成的陽性克隆繼續(xù)擴增培養(yǎng)。陰性對照組以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液同法培養(yǎng)、篩選。

2.4重組pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后β-NGF的表達 收集轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選形成的陽性細胞克隆，以β-NGF抗體進行免疫組織化學(xué)染色檢測β-NGF的表達。先用4%多聚甲醛固定細胞20 min，再用0.01 mol/L PBS液洗去固定液，參考二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒的使用說明進行操作，DAB顯色后光鏡下觀察。其中I抗稀釋度為1∶1 000，陰性對照組以0.01 mol/L PBS液代替I抗。

ELISA檢測β-NGF蛋白的表達：分別收集MSCs和各組轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48～72 h后的上清液，4 ℃保存，48 h內(nèi)進行人β-NGF的ELISA檢測，每組設(shè)6個復(fù)孔；靈敏度為15 ng/L。

2.5重組pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs的生物學(xué)活性鑒定 將本實驗室保存的新生小鼠海馬神經(jīng)元按每個培養(yǎng)培皿1×106個細胞接種在涂有多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后將已收集備用的各組轉(zhuǎn)染細胞上清液與含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液按1∶1的比例加入新生小鼠海馬元培養(yǎng)皿中，觀察細胞生長情況，測定神經(jīng)突起長度并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1MSCs生長情況的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶，4 h后可見到細胞貼壁生長，2 d后呈現(xiàn)勻一梭形成纖維細胞樣形態(tài)，呈集落生長，增殖迅速,見圖1A。原代細胞基本融合時進行傳代培養(yǎng)，傳至第5代時，MSCs形成形態(tài)均一、呈漩渦狀或放射狀排列生長的梭形細胞，見圖1B。CD44、CD54和CD45抗體對原代培養(yǎng)3 d及傳至5代的細胞進行免疫組織化學(xué)染色，第5代細胞的CD44(95.8%±0.8%)、CD54(91.4%±1.3%)陽性率較高，而CD45(2.1%±1.8%)陽性率較低，說明經(jīng)全骨髓貼壁分離法傳代培養(yǎng)，MSCs的純度得到了提高，見圖1C、D。

Figure 1. Culture and identification of MSCs from GFP transgenic mouse.A: primary cells; B: fifth-passage cells after culture; C: CD44 immunopositivity; D: CD54 immunopositivity. Scale bar=100 μm.

圖1GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs的培養(yǎng)和鑒定

2RNA的提取和RT-PCR

RNA提取物經(jīng)甲醛變性凝膠電泳檢測可見18S及28S 2個條帶，見圖2A；RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示為大小為750 bp的特異性擴增條帶，見圖2B。將重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF進行限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切，可見酶切片段與插入基因長度750 bp相符，見圖2C。

Figure 2. Construction and identification of recombinant plasmid pcDNA3-β-NGF. A: formaldehyde-denaturing gel electrophoresis of total RNA from human brain tumor adjacent tissues. B: agarose gel electrophoresis of RT-PCR products. M: DL2000 DNA marker; 1～3: RT-PCR products (about 750 bp). C: agarose gel electrophoresis of digestion products. M: λ-EcoT14 I digest DNA marker; 1: pc-DNA3 digested byHindIII; 2: pcDNA3-β-NGF digested byHindIII andXhoI; 3: pcDNA3-β-NGF digested byHindIII.

圖2重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF的構(gòu)建與雙酶切鑒定

3重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF測序鑒定

將重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF進行限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切，送上海申友公司測序，測序結(jié)果與GenBank公布的人β-NGFcDNA完全一致，見圖3、4。

Figure 3. Sequence analysis of pcDNA3-β-NGF beginning with the sequence of BGH poly(A).

圖3重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF以BGHpoly(A)序列為起點的測序圖

4重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后β-NGF的表達

對轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選的陽性克隆細胞進行二步法免疫組織化學(xué)檢測，DAB顯色后光鏡下觀察，G418篩選的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽性克隆細胞(37.12±2.14)%呈棕色的陽性反應(yīng)，明顯高于MSCs組[(2.36±0.62)%]和空白對照組[(1.43±0.76)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明pcDNA3-β-NGF可以轉(zhuǎn)染MSCs，并使β-NGF表達顯著增加，見圖5A、B。

Figure 4. Sequence analysis of pcDNA3-β-NGF beginning with the sequence of T7 promoter.

圖4重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF以T7啟動子為起點的測序圖

轉(zhuǎn)染pcDNA3-β-NGF的3個單克隆MSCs擴增培養(yǎng)48 h后上清液中β-NGF的含量分別為(96±6.2)ng/L、(81±6.8)ng/L和(74±5.9)ng/L；轉(zhuǎn)染pcDNA3空質(zhì)粒的2個單克隆MSCs和正常培養(yǎng)的MSCs培養(yǎng)48 h后上清液均未檢測到β-NGF蛋白。

5重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后生物學(xué)活性的鑒定

重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs上清液培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元于3 d后在倒置相差顯微鏡下觀察見細胞存活良好，胞體長出明顯的突起；pcDNA3轉(zhuǎn)染MSCs組新生小鼠海馬神經(jīng)元的胞體呈圓形，沒有明顯的突起。pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs組神經(jīng)元的突起長度[(31±3) μm]較pcDNA3轉(zhuǎn)染MSCs組[(23±4) μm]明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明陽性轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清液中的產(chǎn)物能促進新生小鼠海馬神經(jīng)元的突起生長，有明顯的生物學(xué)活性,見圖5C、D。

Figure 5. Biological characteristics of MSCs transfected with recombinant plasmid pcDNA3-β-NGF. A: immunopositive expression of β-NGF in the MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF; B: negative expression of β-NGF in the MSCs transfected with pcDNA3; C: neonatal mouse hippocampal neurons cultured with culture supernatant from the MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF; D: neonatal mouse hippocampal neurons cultured with culture supernatant from the MSCs transfected with pcDNA3. Scale bar=100 μm.

圖5重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后生物學(xué)活性的鑒定

討 論

NGF主要由α、β和γ 3個亞單位組成，對神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、分化、再生及功能發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、功能維持和損傷修復(fù)有密切關(guān)系[1]。然而，NGF不能有效通過血腦屏障，在腦內(nèi)很快降解，需要持續(xù)給藥維持效果，且由于人體廣泛存在NGF受體，易出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[3]。因此，選擇合適的給藥方式向靶部位連續(xù)不斷給藥顯得十分重要。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將細胞替代治療和NGF的神經(jīng)營養(yǎng)能力聯(lián)合應(yīng)用，使受損部位在一段時間內(nèi)持續(xù)大量表達NGF可能是比較理想的給藥方式。

MSCs是一種具有自我復(fù)制、多向分化潛能的成體干細胞，具有免疫原性弱，體外基因轉(zhuǎn)染率高，能穩(wěn)定高效表達外源基因等優(yōu)點，已成為基因治療研究中理想的種子細胞。β亞單位是NGF完整的生物活性單位，不僅對神經(jīng)細胞分化和生長具有有效的神經(jīng)營養(yǎng)作用，還可誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元分化和生長[1-2,8]。因此，本研究通過重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染成功實現(xiàn)了β-NGF在MSCs中的高效表達；轉(zhuǎn)染的MSCs擴增培養(yǎng)后上清液中β-NGF的含量明顯增多，細胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組β-NGF陽性細胞明顯增多，染色更深，提示重組質(zhì)粒β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs可使β-NGF表達顯著增加。

NGF在腦部主要由皮質(zhì)和海馬區(qū)產(chǎn)生，保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元以及紋狀體和海馬區(qū)神經(jīng)元。汪軍兵等[9]研究顯示，NGF可抑制c-Jun氨基端激酶通路的活化，拮抗6-羥基多巴胺所誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的凋亡。本研究中，pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染的MSCs上清液中β-NGF蛋白表達明顯增加；新生小鼠海馬神經(jīng)元與pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染的MSCs上清液共培養(yǎng)后，胞體長出明顯的突起，其長度較pcDNA3轉(zhuǎn)染的MSCs明顯增加，說明β-NGF基因轉(zhuǎn)染后的MSCs具有理想的生物學(xué)活性。

此外，本研究采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，成功分離、培養(yǎng)了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的MSCs，在原代及傳代細胞中均持續(xù)表達GFP，發(fā)出明亮的綠色熒光，為干細胞移植后在體內(nèi)的遷移、定植、分布、分化等研究提供了成熟、有效的示蹤技術(shù)。本研究還采用目前認為特異性相對較高的標記分子CD44和CD54抗體對原代培養(yǎng)3 d及傳至5代的細胞進行免疫組織化學(xué)染色進行鑒定，利用造血細胞的特異性標記CD45作為對照。結(jié)果顯示，傳代培養(yǎng)第5代細胞的CD44和CD54陽性率較高，而CD45陽性率較低，說明經(jīng)貼壁分離傳代培養(yǎng)后，MSCs的純度得到了明顯提高，與Colter等[10]研究一致 。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了人β-NGF真核細胞表達載體并轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs，應(yīng)用ELISA和免疫組織化學(xué)染色檢測等方法證實了構(gòu)建的成功，并在體外培養(yǎng)條件下，驗證了β-NGF的生物學(xué)活性，為進一步的在體移植研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1] Allen SJ, Watson JJ, Shoemark DK, et al. GDNF, NGF and BDNF as therapeutic options for neurodegeneration[J]. Pharmacol Ther,2013,138(2):155-175.

[2] Colafrancesco V,Villoslada P.Targeting NGF-pathway for developing neuroprotective therapies for multiple sclerosis and other neurological diseases[J]. Arch Ital Biol,2011,149(2):183-192.

[3] Saragovi HU, Gehring K. Development of pharmacological agents for targeting neurotrophins and their receptors[J]. Trends Pharmacol Sci, 2000, 21(3):93-98.

[4] Tuszynski MH, Thal L, Pay M, et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease[J]. Nat Med, 2005, 11(5): 551-555.

[5] Uccelli A, Laroni A, Freedman MS. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases[J]. Lancet Neurol, 2011, 10(7): 649-656.

[6] Remy S, Tesson L, Usal C, et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy[J].Transgenic Res, 2010, 19(5):745-763.

[7] Phinney DG. Isolation of mesenchymal stem cells from murine bone marrow by immunodepletion[J]. Methods Mol Biol, 2008, 449:171-186.

[8] 丁 潔,高 山,程 焱,等.神經(jīng)生長因子、Noggin基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 9(6): 553-557.

[9] 汪軍兵,胡景鑫. JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NGF抗6-OHDA誘導(dǎo)PC12細胞凋亡中的作用[J].中國病理生理雜志, 2010, 26(2):277-281.

[10] Colter DC,Class R,DiGirolamo CM,et al.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(7): 3213-3218.

BiologicalcharacteristicsofbonemarrowmesenchymalstemcellsfromGFPtransgenicmicetransfectedwithhumanβ-nervegrowthfactorgene

BI Yong1,2, HONG Juan1, LI Li-qun1, LI Xiao-li1,2, WEI Peng3, SHI Zhen-jiang3, WANG Ting-hua3, ZHANG Xu1,2

(1DepartmentofNeurobiology,2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China;3InstituteofNeuroscience,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China.E-mail:drzhangxu@live.cn)

AIM: To investigate the changes of biological characteristics of GFP transgenic mouse bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs), which were transfected with human β-nerve growth factor (β-NGF) gene in a recombinant eukaryotic expression vector.METHODSMSCs obtained from GFP transgenic mice were isolated, cultured and purified by the whole bone marrow adherence methods. Humanβ-NGFgene was transfected into the MSCs by a recombinant eukaryotic expression vector. The β-NGF expression in the MSCs was detected by the method of immunocytochemistry. Hippocampal neurons from neonatal mice were cultured with culture supernatant of the MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF and the biological characteristics of the MSCs were investigated 3 d after culture under inverted phase-contrast microscope.RESULTSThe β-NGF positive rate of MSCs in pcDNA3-β-NGF transfection group [(37.12±2.14)%] was significantly higher than that in MSCs control group [(2.36±0.62)%] and blank control group [(1.43±0.76)%].The neurite length of neonatal mouse hippocampal neurons cultured with culture supernatant from pcDNA3-β-NGF-transfected MSCs [(31±3)μm] was significantly longer than that in negative control group [(23±4)μm], suggesting that MSCs transfected withβ-NGFgene maintained better biological characteristics.CONCLUSIONThe constructed recombinant eukaryotic expression vector of humanβ-NGFgene can be transfected into MSCs efficiently and NGF can be effectively expressed in MSCs. MSCs transfected withβ-NGFgene are capable of stable expression and secretion of β-NGF, and maintenance of better biological characteristics.

Nerve growth factor; Mesenchymal stem cells; Gene transfection

R741.05; R329.28

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.030

1000- 4718(2013)11- 2082- 06

2013- 04- 08

2013- 10- 16

浙江省高?！笆濉鄙窠?jīng)生物學(xué)重點學(xué)科資助項目(No.204-071006)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No.Y2101091)；溫州市科技計劃項目(No.Y2013S0212；No.Y2013S0239)

△通訊作者 Tel: 0577-55579371; E-mail: drzhangxu@live.cn