宋穎芳， 賴國(guó)祥， 柳德靈， 林慶安， 廖云海

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350025)

1,25-二羥維生素D3負(fù)性調(diào)控被動(dòng)致敏人氣道平滑肌細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路*

宋穎芳， 賴國(guó)祥△， 柳德靈， 林慶安， 廖云海

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350025)

目的探討1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]對(duì)被動(dòng)致敏人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs)中核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路的影響。方法原代培養(yǎng)HASMCs并使之被動(dòng)致敏，以1,25-(OH)2D3作為干預(yù)因素。EMSA法檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性；免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)觀察NF-κB p65的核易位情況；Western blotting法檢測(cè)核因子κB抑制蛋白α(IκBα)及p-IκBα蛋白的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)維生素D受體(VDR)、維生素D 24-羥化酶(CYP24)和IκBα mRNA的表達(dá)水平；放線菌素D處理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IκBα mRNA的表達(dá)。結(jié)果(1) 1,25-(OH)2D3顯著削弱被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性及其亞單位 p65的核易位；(2) 1,25-(OH)2D3能通過(guò)增加被動(dòng)致敏HASMCs中IκBα的mRNA穩(wěn)定性及減少其蛋白磷酸化水平2個(gè)途徑顯著上調(diào)細(xì)胞中IκBα的表達(dá)；(3) 1,25-(OH)2D3顯著上調(diào)被動(dòng)致敏HASMCs中VDR的mRNA表達(dá)并誘發(fā)其功能性反應(yīng)。結(jié)論1,25-(OH)2D3能通過(guò)上調(diào)被動(dòng)致敏HASMCs中IκBα的表達(dá)抑制細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，且這一作用與VDR有關(guān)，這可能是其調(diào)控被動(dòng)致敏HASMCs的重要作用機(jī)制。

哮喘； 氣道平滑肌細(xì)胞； 1,25-二羥維生素D3； 核因子κB； 受體,維生素D

氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的表型改變是支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)氣道重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。核因子κB (nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，近年來(lái)被證實(shí)是調(diào)控ASMCs細(xì)胞表型改變的關(guān)鍵性調(diào)控因子[1]。1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2D3]是體內(nèi)維生素D(vitamin D, Vit D)最重要的活性代謝產(chǎn)物。本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3能抑制人氣道平滑肌細(xì)胞(human airway smooth muscle cells，HASMCs)的表型改變[2]。但這種調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制尚不明確。本研究探討1,25-(OH)2D3對(duì)被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κB信號(hào)通路的影響，旨在明確其調(diào)節(jié)被動(dòng)致敏HASMCs的可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

HASMCs (ScienCell)；放線菌素D(Sigma)；DMEM液(Gibco)； SABC試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；抗NF-κB p65、抗IκBα、抗p-IκBα抗體及ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz)，NE-PERTM試劑盒(Pierce)，Gel Shift Assay Systems試劑盒(Promega)，F(xiàn)astStart SYBR GreenⅠ試劑盒(Roche)。

2HASMCs的培養(yǎng)及分組

HASMCs予以含10%胎牛血清的高糖DMEM液在5%CO2、37 ℃孵箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用4～8代細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[3]予以制備對(duì)照血清及哮喘血清。按隨機(jī)排列表法將細(xì)胞分成3組：(1)對(duì)照組：無(wú)血清DMEM液同步化48 h后，用10%對(duì)照血清處理HASMCs；(2)哮喘組：無(wú)血清DMEM液同步化48 h后，用10%哮喘血清處理HASMCs；(3) Vit D組：用含10-7mol/L 1,25-(OH)2D3的無(wú)血清DMEM液同步化48 h后，用10%哮喘血清處理HASMCs。各組均于血清刺激1 h后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

3電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophreticmobilityshiftassay,EMSA)法檢測(cè)各組HASMCs中的NF-κB活性

使用NE-PERTM試劑盒提取HAMSCs的核蛋白，按Gel Shift Assay Systems試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)標(biāo)記NF-κB寡核苷酸探針(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’；3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’)，并進(jìn)行DNA結(jié)合反應(yīng)，隨后行5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后干膠，置于-70 ℃放射自顯影；圖像分析軟件測(cè)量各樣品電泳滯后帶的相對(duì)吸光度(A)。

4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組HASMCs中NF-κBp65核移位情況

甲醛固定細(xì)胞，用1∶1 000稀釋羊抗人NF-κB p65抗體作為Ⅰ抗，按SABC試劑盒說(shuō)明進(jìn)行SABC法染色，以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。NF-κB p65的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒，可位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)胞核陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)并計(jì)算胞核陽(yáng)性率。

5Westernblotting法檢測(cè)各組HASMC中的IκBα和p-IκBα的表達(dá)

NE-PERTM試劑盒提取HAMSCs總蛋白，10% SDS-PAGE分離樣品細(xì)胞總蛋白并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用1∶1 000稀釋的抗IκBα和p-IκBα抗體分別進(jìn)行蛋白印記分析，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統(tǒng)確定各蛋白條帶的相對(duì)灰度值。

6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組HASMCs中維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)、維生素D24-羥化酶(vitaminD24-hydroxylase,CYP24)和IκBαmRNA的表達(dá)

Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后取2 μL cDNA作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各目的基因引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：VDR：95 ℃ 20 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，38個(gè)循環(huán)；CYP24：95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；IκBα：95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；GAPDH：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)記錄每個(gè)樣品管中的熒光強(qiáng)度增加到熒光閾值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)。以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)含量[目的基因mRNA/GAPDH mRNA=2-ΔCt(ΔCt =Cttarget-CtGAPDH)]。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

7放線菌素D處理實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組HASMCs中IκBαmRNA的表達(dá)

給予10 mg/L的放線菌素D處理細(xì)胞，以終止基因轉(zhuǎn)錄。分別于作用0、1、2、3、4、5和6 h后提取細(xì)胞RNA并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞IκBα mRNA的表達(dá)。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

11,25-(OH)2D3對(duì)NF-κBDNA結(jié)合活性的影響

與對(duì)照組相比，哮喘組HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性明顯升高，其電泳滯后帶的相對(duì)A值是對(duì)照組的(7.78±0.53)倍(P<0.05)；而1,25-(OH)2D3顯著抑制了被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性，其電泳滯后帶的相對(duì)A值僅是對(duì)照組的(5.18±0.31)倍，與哮喘組比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

21,25-(OH)2D3對(duì)被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κBp65核移位的影響

Figure 1. Inhibition of NF-κB DNA-binding activity in passively sensitized HASMCs by 1,25-(OH)2D3.1: non-specific competition; 2: specific competition; 3: control group; 4: asthma group; 5: Vit D group.

圖11,25-(OH)2D3抑制被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κBDNA結(jié)合活性

對(duì)照組細(xì)胞中可見(jiàn)NF-κB p65陽(yáng)性產(chǎn)物棕黃色顆粒，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，其胞核陽(yáng)性率為(13.24±3.58)%；哮喘組陽(yáng)性表達(dá)顆粒明顯增加，且在胞核內(nèi)明顯增加，其胞核陽(yáng)性率較對(duì)照組明顯增高，為(42.76±4.79)% (P<0.05)；而Vit D組陽(yáng)性表達(dá)顆粒核內(nèi)增加不明顯，較為均勻地分布于胞質(zhì)及胞核中，其胞核陽(yáng)性率為(25.58±5.43)%，較哮喘組有所下降(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組,見(jiàn)圖2。

Figure 2. Inhibition of nuclear translocation of NF-κB p65 in passively sensitized HASMCs by 1,25-(OH)2D3(DAB,×400).A: control group; B: asthma group; C: Vit D group.

圖21,25-(OH)2D3抑制被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κBp65的核移位

31,25-(OH)2D3對(duì)被動(dòng)致敏HASMCs中IκBα蛋白表達(dá)水平的影響

Vit D組IκBα蛋白表達(dá)量(0.27±0.04)較哮喘組(0.15±0.03)明顯增高，但兩者均低于對(duì)照組(0.42±0.05)(P<0.05)，即1,25-(OH)2D3能上調(diào)哮喘狀態(tài)下HASMCs中IκBα的蛋白表達(dá),見(jiàn)圖3。

Figure 3. 1,25-(OH)2D3increased IκBα protein expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsasthma group.

圖31,25-(OH)2D3增加被動(dòng)致敏HASMCs中IκBα蛋白的表達(dá)

41,25-(OH)2D3對(duì)IκBαmRNA表達(dá)的影響

哮喘血清中IκBα的mRNA 半衰期為(192.91±8.33)min，而Vit D的預(yù)處理可使其半衰期延長(zhǎng)至(264.13±10.76)min。由此可見(jiàn)1,25-(OH)2D3能顯著增強(qiáng)細(xì)胞中IκBα mRNA的表達(dá)水平，這是1,25-(OH)2D3上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)的主要原因,見(jiàn)圖4。

Figure 4. 1,25-(OH)2D3IκBα mRNA expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.

圖41,25-(OH)2D3增加被動(dòng)致敏HASMCs中IκBαmRNA的表達(dá)

51,25-(OH)2D3對(duì)被動(dòng)致敏HASMCs總蛋白中p-IκBα表達(dá)水平的影響

IκBα蛋白的降解是影響IκBα蛋白表達(dá)的另一重要原因。而磷酸化是IκBα蛋白降解的先決條件。圖3顯示，1,25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中p-IκBα的蛋白表達(dá)。為排除IκBα的表達(dá)水平對(duì)p-IκBα表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)用IκBα蛋白表達(dá)量對(duì)p-IκBα蛋白表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vit D組p-IκBα/IκBα為0.41±0.05，亦顯著低于哮喘組的0.86±0.04 (P<0.05)，但仍高于對(duì)照組的0.17±0.03 (P<0.05)。由此可見(jiàn)1,25-(OH)2D3能抑制IκBα的磷酸化，從而抑制其蛋白降解，這是1,25-(OH)2D3上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)的另一重要原因。

6各組細(xì)胞中VDR及CYP24mRNA的表達(dá)

哮喘組及對(duì)照組僅有極低水平的VDR及CYP24 mRNA表達(dá)，且2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而1,25-(OH)2D3明顯上調(diào)了這2個(gè)目的基因的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，見(jiàn)圖5。這一結(jié)果不僅證實(shí)了VDR在HASMCs中的表達(dá)，而且還說(shuō)明1,25-(OH)2D3能有效上調(diào)HASMCs中VDR的表達(dá)并誘發(fā)其功能性反應(yīng)。

Figure 5. 1,25-(OH)2D3increased VDR (A) and CYP24 (B) mRNA expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsasthma group.

圖5各組HASMCs中VDR及CYP24mRNA的水平

討 論

1,25-(OH)2D3主要通過(guò)與VDR的結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。隨著VDR被明確為哮喘的易感基因，1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘的調(diào)節(jié)作用受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注[4]。ASMCs的細(xì)胞表型改變是哮喘氣道重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，目前已成為哮喘氣道重塑研究及治療的重要標(biāo)靶。本課題組的前期研究首次發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3能抑制哮喘狀態(tài)下HASMCs的高增殖狀態(tài)并抑制其表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶9，從細(xì)胞水平初步揭示了1,25-(OH)2D3調(diào)節(jié)哮喘氣道重塑的能力[2]。Damera等[5]亦證實(shí)1,25-(OH)2D3能抑制血小板源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的HASMCs增殖，并指出這種抑制作用是通過(guò)1,25-(OH)2D3對(duì)細(xì)胞檢測(cè)點(diǎn)激酶1和Rb蛋白的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)。但這種作用機(jī)制并不足以解釋1,25-(OH)2D3對(duì)HASMCs表達(dá)MMP-9的抑制作用，因此1,25-(OH)2D3勢(shì)必存在其它信號(hào)通路來(lái)同時(shí)調(diào)控HASMCs的增殖和MMP-9的表達(dá)。

NF-κB信號(hào)通路是哮喘發(fā)病機(jī)制中最受關(guān)注的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，其在哮喘患者氣道中被過(guò)度活化[6]?，F(xiàn)已明確，NF-κB的活化須具備2個(gè)條件：(1)與IκB的解離；(2) NF-κB的核移位。故判斷NF-κB的活性水平時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào)以下2點(diǎn)：NF-κB的核移位和IκB的降解水平。

本研究不僅用經(jīng)典的EMSA法證實(shí)1,25-(OH)2D3能顯著抑制被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κB的DNA結(jié)合活性，而且還用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法直觀地證實(shí)1,25-(OH)2D3能有效地抑制細(xì)胞中NF-κB的核移位。IκB是NF-κB的主要抑制蛋白, 在已知的IκB家族成員中，IκBα與NF-κB活化關(guān)系最為密切，其含量的變化能間接反應(yīng)NF-κB的活化程度。本研究亦證實(shí)1,25-(OH)2D3能通過(guò)增加被動(dòng)致敏HASMCs中IκBα mRNA的表達(dá)及減少其磷酸化水平而顯著上調(diào)細(xì)胞中IκBα的表達(dá)，即抑制IκBα的降解。上述結(jié)果說(shuō)明1,25-(OH)2D3具有抑制被動(dòng)致敏HASMCs中NF-κB活化的能力。

鑒于NF-κB是調(diào)節(jié)哮喘狀態(tài)下ASMCs功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，有理由認(rèn)為1,25-(OH)2D3對(duì)HASMCs中NF-κB活化的這種抑制作用在其調(diào)節(jié)HASMCs的功能中扮演著重要的角色，這不僅為拓展1,25-(OH)2D3在哮喘治療中的臨床應(yīng)用提供了最基礎(chǔ)的理論依據(jù)；而且還為臨床治療哮喘(尤其是難治性哮喘)、慢性阻塞性肺疾病等ASMCs過(guò)度增殖性疾病開(kāi)辟了新的研究平臺(tái)。

業(yè)已證實(shí)，1,25-(OH)2D3的生物學(xué)效應(yīng)與靶組織中的VDR含量直接相關(guān)，它可通過(guò)增強(qiáng)VDR蛋白的穩(wěn)定性等多種方式上調(diào)VDR的表達(dá)[7]。而VDR是NF-κB活性調(diào)控中的重要上游分子：VDR不僅能直接上調(diào)IκBα的表達(dá)并增強(qiáng)IκBα的穩(wěn)定性[8]，而且還與NF-κB的亞單位 p65存在生理性結(jié)合，通過(guò)直接阻礙p65的核易位及其與DNA的結(jié)合活性等方式來(lái)直接抑制NF-κB p65的活性[9]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)在胚胎成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞等多種細(xì)胞中，1,25-(OH)2D3正是借由與VDR的受體配體效應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而細(xì)胞特異性地調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)功能[10-11]。有意思的是，本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)VDR存在于HASMCs上，且1,25-(OH)2D3能顯著上調(diào)被動(dòng)致敏HASMCs中VDR的mRNA水平并誘發(fā)其功能性反應(yīng)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中1,25-(OH)2D3調(diào)節(jié)NF-κB活性研究的相關(guān)結(jié)果，推測(cè)1,25-(OH)2D3對(duì)HASMCs中NF-κB的抑制作用可能也是VDR依賴性的，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將對(duì)這一可能作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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1,25-dihydroxyvitaminD3inhibitsnuclearfactorkappaBsignalingpathwayinpassivelysensitizedhumanairwaysmoothmusclecells

SONG Ying-fang, LAI Guo-xiang, LIU De-ling, LIN Qing-an, LIAO Yun-hai

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou350025,China.E-mail:laiguoxiang2007@163.com)

AIM: To investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25-(OH)2D3] on nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway in passively sensitized human airway smooth muscle cells (HASMCs).METHODSHASMCs were passively sensitized with 10% serum from asthmatic patients. 1,25-(OH)2D3was used as an interfering factor. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to detect the DNA-binding activity of NF-κB. Immunocytochemical staining was used to observe the nuclear translocation of NF-κB p65. Western blotting was used for IκBα and phosphorylated IκBα protein detection. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine vitamin D receptor (VDR), vitamin D 24-hydroxylase (CYP24) and IκBα mRNA expression. The mRNA expression of IκBα in HASMCs after actinomycin D treatment was also determined.RESULTS(1) 1,25-(OH)2D3significantly attenuated the DNA-binding activity of NF-κB and the nuclear translocation of NF-κB p65 in HASMCs passively sensitized by asthmatic serum. (2) 1,25-(OH)2D3enhanced IκBα mRNA stability and inhibited IκBα protein phosphorylation in passively sensitized HASMCs, thus increasing IκBα expression in these HASMCs. (3) 1,25-(OH)2D3up-regulated VDR mRNA level and evoked its functional response in passively sensitized HASMCs.CONCLUSION1,25-(OH)2D3enhanced the expression of IκBα and therefore inhibited NF-κB signaling passway in HASMCs. This effect may be dependent on VDR, and responsible for the inhibitory effect of 1,25-(OH)2D3on passively sensitized HASMCs.

Asthma; Airway smooth muscle cells; 1,25-Dihydroxyvitamin D3; Nuclear factor kappa B; Receptors, vitamin D

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.023

1000- 4718(2013)11- 2044- 05

2013- 03- 21

2013- 08- 23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81100011)；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2011J05087)

△通訊作者 Tel: 0591-22859333； E-mail: laiguoxiang2007@163.com