梁 慶, 李自成, 鄺素華, 黃偉青, 黃敏堅(jiān), 林俊敏, 梁子敬

(1暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科, 廣東 廣州 510630；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 2急診科, 3心臟外科, 廣東 廣州 510120)

美托洛爾抑制NE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡及縫隙連接蛋白43的磷酸化*

梁 慶1,2, 李自成1△, 鄺素華3, 黃偉青2, 黃敏堅(jiān)2, 林俊敏2, 梁子敬2

(1暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科, 廣東 廣州 510630；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2急診科,3心臟外科, 廣東 廣州 510120)

目的研究美托洛爾(Meto)對(duì)去甲腎上腺素(NE)刺激下乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及縫隙連接蛋白43(Cx43)磷酸化水平的影響。方法新生SD乳鼠心肌細(xì)胞分為5組：(1)對(duì)照組(Con組，n=6)；(2) NE組(n=6)：在細(xì)胞中加入0.1 μmol/L NE孵育24 h；(3) NE+Meto組(n=6):細(xì)胞中同時(shí)加入0.1 μmol/L NE和0.1 μmol/L Meto孵育24 h；(4)NE+Meto+ PD98059組(n=6):細(xì)胞中提前30 min加入ERK磷酸化抑制劑10 μmol/L PD98059，后同時(shí)加入0.1 μmol/L NE和0.1 μmol/L Meto孵育24 h；(5)NE+PD98059組(n=6)：細(xì)胞中提前30 min加入10 μmol/L PD98059，后加入0.1 μmol/L NE孵育24 h。24 h后計(jì)算各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率, MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，RT-PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Cx43 mRNA表達(dá)，采用 Western bloting法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞p-Cx43、p-ERK1/2和活化caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果(1)NE單獨(dú)處理可顯著增高心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和降低心肌細(xì)胞活性，Meto阻斷則可顯著降低心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和顯著提高細(xì)胞活性；而PD98059單獨(dú)處理則對(duì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率無(wú)明顯影響，但PD98059處理后可在一定程度上抑制Meto提高細(xì)胞活性的作用。(2)與Con組比較，NE單獨(dú)處理可顯著上調(diào)心肌細(xì)胞Cx43 mRNA表達(dá)(P<0.01)；而與NE組比較，Meto(P<0.01)或PD98059(P<0.01)的單獨(dú)干預(yù)均可顯著抑制Cx43 mRNA的表達(dá)，且Meto和PD98059兩者共處理心肌細(xì)胞可進(jìn)一步抑制NE上調(diào)Cx43 mRNA表達(dá)的作用(P<0.01)。 (3)與NE組比較，Meto可顯著抑制NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p-Cx43、p-ERK1/2和活化caspase-3表達(dá)增加(P<0.01)，PD98059和Meto兩者共處理后可進(jìn)一步增強(qiáng)Meto對(duì)p-Cx43、p-ERK1/2和活化caspase-3表達(dá)的抑制(P<0.01)；而PD98059單獨(dú)處理對(duì)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p-Cx43和活化caspase-3表達(dá)增加則無(wú)顯著影響(P>0.05)。結(jié)論美托洛爾對(duì)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用與其獨(dú)特的Cx43磷酸化抑制作用有關(guān),該作用可能部分經(jīng)由ERK1/2通路介導(dǎo)。

乳鼠心肌細(xì)胞； 美托洛爾； 去甲腎上腺素； 縫隙連接蛋白43

縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是心臟中表達(dá)最豐富的連接蛋白，其構(gòu)成的縫隙連接(gap junction, GJ)通道介導(dǎo)心肌細(xì)胞間的電偶聯(lián)及化學(xué)信息交流。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高β1選擇性的腎上腺素受體阻斷劑美托洛爾(metoprolol,Meto)不同異構(gòu)體均能阻止Cx43構(gòu)成的GJ的降解而上調(diào)離體乳鼠心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)和改變Cx43磷酸化水平，且可能通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用[1-3]。已知在異丙腎上腺素刺激下，心肌細(xì)胞中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的增加主要是通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2)通路實(shí)現(xiàn)[3]。ERK1/2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種，為有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)中的一種亞型。MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是心肌細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4-5]。

已知交感神經(jīng)興奮及高去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)水平是心力衰竭(heart failure，HF)患者體液的主要特征。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在壓力負(fù)荷型HF大鼠中隨著Meto治療劑量的逐級(jí)增加磷酸化Cx43(phosphorylated connexin 43, p-Cx43)表達(dá)量出現(xiàn)逐級(jí)降低。為進(jìn)一步探討Meto對(duì)NE刺激下心肌細(xì)胞Cx43磷酸化水平的調(diào)控是否具有心肌保護(hù)意義及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，我們用NE處理乳鼠心肌細(xì)胞，并用Meto及ERK1/2信號(hào)通路的上游特異性阻斷劑PD98059進(jìn)行干預(yù)，探討Meto對(duì)抗NE毒性的心肌保護(hù)機(jī)制，為臨床防治HF提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要材料及試劑

Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 高糖培養(yǎng)基(Sigma)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;JRH Bioscience)；ERK磷酸化抑制劑PD98059(Cell Signaling Technology)；重酒石酸去甲腎上腺素(Sigma)、酒石酸美托洛爾(Sigma)；噻唑藍(lán)(methyl thiazoyltetrazolium，MTT)(Sigma)；總RNA提取試劑盒(Omega)，PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)；p-Cx43兔抗鼠多克隆抗體、磷酸化p44/42 MAPK (p-ERK1/2) 兔抗鼠單克隆抗體和cleaved caspase-3兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology)，抗GAPDH兔多克隆抗體(北京康為)。

2方法

2.1新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 取出生1～2 d Sprague-Dawley(SD)新生大鼠(由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)No.4402101396)心臟分離和培養(yǎng)心肌細(xì)胞，方法參考文獻(xiàn)[3]。動(dòng)物處置符合暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)管理規(guī)定。心肌細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后已貼壁并已伸展，3～4 d時(shí)搏動(dòng)性好，吸出培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入不同藥物，細(xì)胞處理分以下各組：(1)對(duì)照(control，Con)組(n=6)：心肌細(xì)胞不作任何處理；(2) NE組(n=6)：在細(xì)胞中加入0.1 μmol/L NE孵育24 h；(3) NE+Meto組(n=6):細(xì)胞中同時(shí)加入0.1 μmol/L NE和0.1 μmol/L Meto孵育24 h；(4)NE+Meto+PD98059組(NE+Meto+PD組，n=6):細(xì)胞中提前30 min加入10 μmol/L PD98059，后同時(shí)加入0.1 μmol/L NE和0.1 μmol/L Meto孵育24 h；(5)NE+PD98059組(NE+PD組，n=6)，細(xì)胞中提前30 min加入10 μmol/L PD98059，后加入0.1 μmol/L NE孵育24 h。

2.2心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率計(jì)算 倒置顯微鏡下觀察在NE和(或)Meto處理前及處理24 h后在培養(yǎng)板中的各組乳鼠心肌細(xì)胞，每一孔分為4個(gè)象限。選取節(jié)律正常的細(xì)胞簇進(jìn)行記錄,計(jì)算在每一象限的每分鐘心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)次數(shù)，取4個(gè)象限的平均值。每組重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。

2.3細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞活性。藥物處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞接種到96孔板，5×104cells/well,加入含5 g/L MTT的1×PBS溶液20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、2%CO2)培養(yǎng)4 h后吸棄溶液，每孔加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)，15 min后待結(jié)晶完全溶解，在波長(zhǎng)570 nm處讀取A值間接反映活細(xì)胞數(shù)量。設(shè)置只加培養(yǎng)液的空白孔用于調(diào)零。細(xì)胞生存率計(jì)算公式：細(xì)胞生存率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

2.4RT-PCR 采用Primer 5.0軟件,參照GenBank資料設(shè)計(jì)引物, 送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成及測(cè)序。Cx43引物序列為正義鏈 5’-ATGGGTGACTGGAGTGCCTTGG-3’,反義鏈5’-AATCTCCAGGTCATCAGGCCG-3’(1 146 bp)。GAPDH引物序列為正義鏈5’-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC-3’,反義鏈5’-GGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTC-3’(550 bp)。藥物處理24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗并收集各組心肌細(xì)胞，參照Omega總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，測(cè)定濃度后1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。參照TaKaRa二步法試劑盒說明書行RT-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次，最后72 ℃ 10 min。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，電壓80 V，時(shí)間60 min。結(jié)束后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照，通過NIH ImageJ軟件計(jì)算目的基因與GAPDH的灰度比值，半定量目的基因表達(dá)水平。

2.5蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用 Western blotting法。每孔1×106細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，吸棄培養(yǎng)液，加入65 μL裂解液將樣本40 W超聲裂解3次，每次10 s。4 ℃ 12 000×g離心15 min，收取上清BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。加入1∶400 p-Cx43兔抗鼠多克隆抗體、1∶1 000 cleaved caspase-3兔抗鼠單克隆抗體、1∶1 000 p-ERK1/2兔抗鼠單克隆抗體, 4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，以GAPDH(1∶2 000)抗體作內(nèi)參照。洗膜后ECL試劑顯影、定影，Epson 彩色圖像掃描儀獲取蛋白質(zhì)信號(hào)條帶圖像后運(yùn)用ImageJ圖像分析軟件分析，通過計(jì)算目的蛋白與GAPDH蛋白灰度的比值來(lái)衡量其表達(dá)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1不同藥物對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率的影響

各組心肌細(xì)胞在給予NE和(或)Meto處理前的基礎(chǔ)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率組間比較無(wú)顯著差異。在給予NE和(或)Meto處理后可見NE組及NE+PD組搏動(dòng)頻率較Con組均顯著增高(P<0.01)，而NE組及NE+PD組之間則無(wú)顯著差異；NE+Meto組及NE+Meto+PD組搏動(dòng)頻率亦較Con組均顯著增高(P<0.01)，與NE組比較則均有所下降(P<0.05)，而NE+Meto組及NE+Meto+PD組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1不同藥物對(duì)成簇大鼠乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率的影響

Table 1. Effects of different drugs on spontaneously beating rate of clustered neonatal rat cardiomyocytes (min-1. Mean±SD.n=6)

Group0h24hCon104.67±5.92103.50±5.79NE102.50±6.69155.83±6.01**NE+Meto101.33±4.76133.83±2.48**#NE+Meto+PD103.83±2.64135.50±3.21**#NE+PD105.33±7.28154.67±5.47**

**P<0.01vsCon group;#P<0.05vsNE group.

2MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞活性結(jié)果

與Con組比較，NE組細(xì)胞活性顯著降低(54.67%±6.62%，P<0.01)；與NE組比較，NE+Meto組(80.33%±3.44%，P<0.01)及NE+Meto+PD(72.50%±3.39%，P<0.01)的細(xì)胞活性顯著增高，而NE+PD組(56.83%±6.31%)細(xì)胞活性變化無(wú)顯著差異；NE+Meto組與NE+Meto+PD組之間細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. MTT analysis of neonatal rat cardiomyocytes viability in various groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCon group;P<0.01vsNE group;#P<0.05vsNE+Meto group.

圖1MTT法分析各組大鼠乳鼠心肌細(xì)胞活性

3Cx43mRNA的RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示，與Con組(Cx43/GAPDH：0.36±0.05)比較，NE處理可顯著上調(diào)Cx43 mRNA表達(dá)，差異顯著(P<0.01)；與NE組(Cx43/GAPDH：1.25±0.07)比較， NE+Meto組(Cx43/GAPDH：0.52±0.06，P<0.01)、NE+Meto+PD組(Cx43/GAPDH：0.22±0.06，P<0.01)和NE+PD組(Cx43/GAPDH：0.35±0.06，P<0.01)Cx43 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步行NE+Meto組、NE+Meto+PD組和NE+PD組各組間兩兩比較，Cx43 mRNA表達(dá)差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

4磷酸化Cx43、磷酸化ERK1/2及活化caspase-3蛋白Westernbloting檢測(cè)結(jié)果

從圖3及表2可見，與Con組比較，NE組p-Cx43、p-ERK1/2及cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與NE組比較，NE+Me組及NE+Meto+PD組的p-Cx43、p-ERK1/2及cleaved caspase-3表達(dá)顯著減少(P<0.01)，NE+PD組p-ERK1/2表達(dá)亦顯著減少(P<0.01)，而NE+PD組p-Cx43、cleaved caspase-3表達(dá)較NE組無(wú)顯著差異。進(jìn)一步兩兩間比較NE+Meto+PD組較NE+Meto組的p-Cx43、p-ERK1/2及cleaved caspase-3表達(dá)顯著減少(P<0.01)，NE+Meto+PD組較NE+PD組的p-Cx43(P<0.01)、p-ERK1/2(P<0.05)及cleaved caspase-3(P<0.01)表達(dá)亦顯著減少。

Figure 2. Semi-quantitative analysis of neonatal rat cardiomyocyte Cx43 mRNA expression in various groups by RT-PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCon group;P<0.01vsNE group.

圖2各組乳鼠心肌細(xì)胞Cx43mRNART-PCR半定量分析

Figure 3. Expression of p-Cx43,p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 proteins in neonatal rat cardiomyocytes in various groups.

圖3各組乳鼠心肌細(xì)胞p-Cx43、p-ERK1/2和cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)

表2各組乳鼠心肌細(xì)胞p-Cx43、p-ERK1/2和cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)

Table 2. Semi-quantitative analysis of neonatal rat cardiomyocyte p-Cx43, p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 protein expression by Western blotting in various groups (Mean±SD.n=6)

Groupp-Cx43/GAPDHp-ERK1/2/GAPDHCleavedcaspase-3/GAPDHCon0.38±0.040.79±0.080.30±0.06 NE1.59±0.06**1.33±0.16**0.91±0.07**NE+Meto1.23±0.16##1.19±0.08##0.61±0.04##NE+Meto+PD1.12±0.10##▲▲■■0.80±0.07##▲▲■0.35±0.05##▲▲■■NE+PD1.63±0.070.89±0.030.95±0.09

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsNE group;▲▲P<0.01vsNE+Meto group;■P<0.05,■■P<0.01vsNE+PD group.

討 論

HF作為各種病因?qū)е滦呐K收縮及舒張功能損傷的最終共同通路，其中心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。作為交感神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，NE的慢性刺激對(duì)心臟有直接及間接的毒性作用，大量研究證實(shí)NE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是心衰發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[6]。NE的有害作用主要通過激動(dòng)心臟α及β1腎上腺素受體介導(dǎo)，而腎上腺素受體阻滯劑可對(duì)抗這一效應(yīng)從而抑制NE的心臟毒性而抑制心肌細(xì)胞凋亡給心衰的治療帶來(lái)了新希望。然而NE導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍不清楚，涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2,5]。

目前研究較多的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括：(1)MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；(2)死亡受體通路,即細(xì)胞因子(Fas/TNF-α受體)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；(3)線粒體死亡通路(由促凋亡Bax家族蛋白和抗凋亡Bcl- 2家族蛋白及下游的凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3調(diào)節(jié)；(4)活性氧(reactive oxygen species，ROS)通路(線粒體)；(5)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激死亡通路(未折疊蛋白反應(yīng))。其中caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵位置和中心環(huán)節(jié)，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其含量增加，可引發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。第一信使如NE作用于細(xì)胞膜受體后可同時(shí)激活多條通路，各通路之間形成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行對(duì)話(cross-talk)形成動(dòng)態(tài)平衡而調(diào)控病理生理效應(yīng)，不能孤立理解每一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究中我們觀察到在MTT實(shí)驗(yàn)中NE顯著降低心肌細(xì)胞活性，而Meto可顯著提高心肌細(xì)胞活性，而PD98059處理后可在一定程度上抑制Meto改善心肌細(xì)胞活性。而在心肌細(xì)胞搏動(dòng)實(shí)驗(yàn)中NE處理可顯著增高心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率，Meto阻斷則可顯著降低心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率，而PD98059單獨(dú)處理則對(duì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率無(wú)明顯影響。故推測(cè)Meto顯著提高心肌細(xì)胞活性的作用不單純依賴其β受體特別是β1受體阻斷作用，而與ERK1/2通路介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。在Cx43 mRNA檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)美托洛爾或PD98059的單獨(dú)干預(yù)均可抑制NE誘導(dǎo)的Cx43 mRNA的表達(dá)上調(diào)，且美托洛爾和PD98059兩者共處理心肌細(xì)胞時(shí)可進(jìn)一步抑制NE上調(diào)Cx43 mRNA表達(dá)。可見在去甲腎上腺素刺激下，心肌細(xì)胞中連接蛋白43 mRNA表達(dá)的增加與ERK1/2 通路介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

但在各組乳鼠心肌細(xì)胞p-Cx43、p-ERK1/2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)比較中我們發(fā)現(xiàn)美托洛爾雖然可顯著抑制NE誘導(dǎo)的p-Cx43、p-ERK1/2和活化caspase-3的表達(dá)增加，且PD98059和美托洛爾共處理后可進(jìn)一步增強(qiáng)美托洛爾對(duì)p-Cx43、p-ERK1/2和活化caspase-3表達(dá)的抑制；但PD98059單獨(dú)處理對(duì)NE誘導(dǎo)的p-Cx43和活化caspase-3表達(dá)增加無(wú)顯著影響。上述結(jié)果提示美托洛爾對(duì)細(xì)胞凋亡過程中最主要終末剪切酶caspase-3活化形式表達(dá)的抑制作用可能部分依賴ERK1/2通路，并與該通路介導(dǎo)的Cx43去磷酸化狀態(tài)的保持可能有關(guān)。

Cx構(gòu)成的心臟GJ通道是心肌細(xì)胞間通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，分子量小于1 kD、直徑小于1.5 nm的多種物質(zhì)如代謝物、離子、第二信使、水分子等都可通過，并可在電興奮組織中傳導(dǎo)電沖動(dòng)[9]。作為心臟中表達(dá)最豐富的Cx，Cx43的磷酸化與去磷酸化對(duì)GJ通道的功能有著非常重要的影響作用。我們前期的研究表明Cx43的羧基末端241～382為主要的磷酸化區(qū)，也是多種激素的識(shí)別位點(diǎn)，大多數(shù)蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生于此，羧基末端絲/蘇氨酸殘基的磷酸化程度決定著GJ通道的通透性[10]。在心肌細(xì)胞，Cx43的磷酸化使GJ通道關(guān)閉，去磷酸化使該通道開放。在心肌細(xì)胞，去磷酸化不僅可使GJ通道開放，而且是通道解聚的關(guān)鍵點(diǎn)，Cx43一旦去磷酸化，通道即開始解聚為Cx亞單位，Cx亞單位可進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)入胞內(nèi)儲(chǔ)存。新近研究發(fā)現(xiàn)在Cx43半通道的開放及胞內(nèi)ERKs的激活抑制了骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的凋亡，這與維持細(xì)胞間生存信號(hào)(intracellular survival signaling)的交流和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有關(guān)[11-14]。

總之，美托洛爾對(duì)NE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用與其獨(dú)特的Cx43磷酸化抑制作用有關(guān),該作用可能部分經(jīng)由ERK1/2通路介導(dǎo)。據(jù)此我們推測(cè)不同β受體阻斷劑對(duì)Cx43表達(dá)和磷酸化水平影響的差異可能與心肌細(xì)胞凋亡抑制水平存在相關(guān)，相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步深入研究將為臨床合理選擇腎上腺素受體阻滯劑治療HF和開發(fā)新的HF治療靶點(diǎn)提供有力的細(xì)胞及分子水平的依據(jù)。

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Metoprololinhibitsnorepinephrine-inducedratcardiomyocyteapoptosisandconnexin43phosphorylation

LIANG Qing1,2, LI Zi-cheng1, KUANG Su-hua3, HUANG Wei-qing2, HUANG Min-jian2, LIN Jun-min2, LIANG Zi-jing2

(1DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofEmergencyMedicine,3DepartmentofCardiacSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:zichengli@163.net)

AIM: To study the effects of metoprolol (Meto) on the apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes and the phosphorylation of connexin 43 (Cx43) induced by norepinephrine (NE).METHODSNeonatal SD rat cardiomyocytes were divided into the following five groups (n=6 in each group): (1) control (Con) group: no treatment; (2) NE group: treatment with NE at 0.1 μmol/L for 24 h; (3) NE+Meto group: simultaneous treatment with NE and Meto both at 0.1 μmol/L for 24 h; (4) NE+Meto+PD98059 group: pretreatment with extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation inhibitor PD98059 at 10 μmol/L for 30 min and then treatment with NE and Meto both at 0.1 μmol/L for 24 h; (5) NE+PD98059 group: pretreatment with PD98059 at 10 μmol/L for 30 min and then treatment with NE at 0.1 μmol/L for 24 h. The beating rates of cardiomyocytes in various groups were calculated, and the viability of cardiomyocytes was assayed by MTT method. The Cx43 mRNA expression was detected by RT-PCR, and the protein expression of phosphorylated Cx43 (p-Cx43), phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) and cleaved caspase-3 was detected by Western blotting.RESULTS(1) Separate NE treatment could significantly increased the beating rate of cardiomyocytes and reduced cell viability, while Meto showed the opposite effects. PD98059 treatment had no significant effect on cardiomyocyte beating rate, but suppressed Meto to improve cell viability to some extent. (2) Compared with Con group, separate NE treatment significantly increased the Cx43 mRNA expression (P<0.01). Compared with NE group, Meto or PD98059 intervention could significantly inhibited Cx43 mRNA expression (bothP<0.01), and simultaneous treatment with Meto and PD98059 could further suppress Cx43 mRNA expression up-regulated by NE (P<0.01). (3) Compared with NE group, Meto significantly inhibited the increased p-Cx43, p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 expression induced by NE (P<0.01), and simultaneous treatment with Meto and PD98059 could further enhance the inhibition of p-Cx43, p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 expression by Meto (P<0.01). PD98059 treatment had no significant effect on the increased p-Cx43 and cleaved caspase-3 expression induced by NE (P>0.05).CONCLUSIONThe inhibitory effect of Meto on NE-induced cardiomyocyte apoptosis is related to the inhibition of Cx43 phosphorylation, which may be partly mediated via ERK1/2 pathway.

Neonatal rat cardiomyocytes; Metoprolol; Norepinephrine; Connexin 43

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.019

1000- 4718(2013)11- 2024- 06

2013- 07- 17

2013- 08- 12

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助(No.A2013251)；廣州市科技計(jì)劃(No.2010Y1-C941)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(No.20131A011142)

△通訊作者 Tel: 020-38688665; E-mail: zichengli@163.net