劉根林, 袁風(fēng)菊, 陸慈溧, 趙 競, 金可可, 田新橋, 邱俏蒙△, 李劍敏△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院急診科， 2附屬第一醫(yī)院病理科， 3環(huán)境與衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系, 4病理生理學(xué)教研室， 5附屬第二醫(yī)院超聲影像科， 浙江 溫州 325000)

銀杏葉提取物對I型糖尿病心肌病大鼠心肌TGF-β1和collagen表達(dá)及間質(zhì)纖維化的影響*

劉根林1, 袁風(fēng)菊2, 陸慈溧3, 趙 競4, 金可可4, 田新橋5, 邱俏蒙1△, 李劍敏2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1附屬第一醫(yī)院急診科，2附屬第一醫(yī)院病理科，3環(huán)境與衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,4病理生理學(xué)教研室，5附屬第二醫(yī)院超聲影像科， 浙江 溫州 325000)

目的研究銀杏葉提取物(EGB)對I型糖尿病心肌病大鼠心肌TGF-β1和collagen表達(dá)及間質(zhì)纖維化的影響。方法(1)在體實(shí)驗(yàn)，取30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(CON組)、糖尿病組(DM組)和EGB干預(yù)組(EGB組)；用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)I型糖尿病大鼠模型，于第12周末測定大鼠體重、左心室重量、血糖、糖化血紅蛋白和血胰島素；用超聲心動(dòng)圖儀檢測左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和每搏射血量(SV)；用天狼星紅染色、免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR方法分別檢測左心室心肌膠原含量、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)蛋白表達(dá)及TGF-β1、 procollagen I和collagen III mRNA表達(dá)。(2)離體實(shí)驗(yàn)，分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞并分別用低糖(LG組)、高糖培養(yǎng)基(HG組)和EGB干預(yù)(HG+EGB組)；RT-PCR方法檢測各組心肌細(xì)胞TGF-β1、 procollagen I和collagen III 的mRNA表達(dá)。結(jié)果(1)與CON組相比，DM組大鼠血糖(P<0.01)、糖化血紅蛋白(P<0.05)、左心室重量指數(shù)(P<0.01)、心肌間質(zhì)膠原纖維含量(P<0.05)以及心肌組織內(nèi)TGF-β1(P<0.05)、procollagen I(P<0.05)和collagen III(P<0.05)表達(dá)均明顯升高，而血胰島素水平(P<0.01)、LVEDV (P<0.01)和SV (P<0.01)明顯降低；EGB干預(yù)治療后，與DM組相比，EGB組糖尿病大鼠血糖(P<0.01)、糖化血紅蛋白(P<0.05)、左心室重量指數(shù)(P<0.05)、心肌間質(zhì)膠原纖維含量(P<0.05)以及心肌組織內(nèi)TGF-β1(P<0.05)、 procollagen I(P<0.05)和collagen III(P<0.05)表達(dá)均明顯降低，血胰島素水平(P<0.05)、LVEDV (P<0.05)和SV (P<0.05)明顯升高。(2)與LG組比較，HG組心肌細(xì)胞TGF-β1(P<0.01)、procollagen I(P<0.01)和collagen III(P<0.01) mRNA表達(dá)明顯升高；而EGB干預(yù)后，與HG組比較，EGB組心肌細(xì)胞TGF-β1(P<0.01)、procollagen I(P<0.01)和collagen III(P<0.01)mRNA表達(dá)明顯降低。結(jié)論EGB可通過調(diào)低糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1的表達(dá)，減少心肌間質(zhì)中collagen I和III合成及沉積，從而改善糖尿病心肌病大鼠早期的心肌纖維化及左心室舒張功能。這提示通過有效降低心肌TGF-β1的表達(dá)減少心肌間質(zhì)纖維化可能是EGB防治糖尿病心肌病的重要機(jī)制之一。

糖尿病； 銀杏葉提取物； 心肌纖維化

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)作為糖尿病(diabetes mellitus, DM)的一大并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著DM病人的生命安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示：大約80%的DM病人死于心臟病發(fā)作或中風(fēng)[1],已有文獻(xiàn)報(bào)道脂質(zhì)過氧化作用和一氧化氮所致的損傷參與其中[2]。銀杏葉提取物(extract ofGingkobiloba，EGB) 主要成分是黃酮類和萜類內(nèi)酯化合物。其中黃酮類甙是一類抗氧化劑，已被證實(shí)具有清除自由基和調(diào)節(jié)NO的作用[3]。萜類內(nèi)酯化合物是公認(rèn)的血小板激活因子拮抗劑,被廣泛用于心腦血管疾病。然而EGB對糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化的影響未見報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)通過在體的I型糖尿病動(dòng)物模型和離體心肌細(xì)胞的培養(yǎng)以及EGB干預(yù)治療，結(jié)合血液生化、組織學(xué)特殊染色、心功能檢測和免疫組織化學(xué)及RT-PCR等手段，觀察EGB對DCM左心功能及心肌間質(zhì)纖維化的影響，探討EGB抑制DCM心肌間質(zhì)纖維化的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 在體實(shí)驗(yàn)：Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠 180～200 g,鼠齡2個(gè)月，SPF級(jí)。離體實(shí)驗(yàn)：出生1～2 d SD大鼠乳鼠，雌雄不拘。所用動(dòng)物均由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為浙溫動(dòng)字20030002。

1.2試劑和儀器 鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)、枸櫞酸鈉(分析純)、天狼星紅染色試劑均購于Sigma；Liberase TH購于羅氏；高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco；EGB購于北京雙鶴高科天然藥物有限公司；Johnson穩(wěn)步倍加血糖儀；胰島素檢測試劑盒和糖基化血紅蛋白(glycosyla-ted hemoglobin,GHb)檢查試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；UV-754型紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；Vivid 7超聲心動(dòng)圖儀(GE Healthcare)；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)免疫組織化學(xué)試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1、procollagen I、collagen III及β-actin引物合成并訂購于上海生工生物工程有限公司；MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)(Ultra-Lum)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo);T1-SM倒置顯微鏡(Nikon)。

2方法

2.1動(dòng)物模型的建立、分組及處理 雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分成正常對照組(CON組,10只)和造模組(20只)，造模組按我們以往報(bào)道的方法利用STZ誘導(dǎo)制作I型糖尿病大鼠模型并給予EGB干預(yù)治療[3]，將造模成功后的20只大鼠隨機(jī)分成2組，每組10只，分別為糖尿病對照組(DM組)和EGB干預(yù)組(EGB組)。所有動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)12周。實(shí)驗(yàn)過程中DM組和EGB組大鼠各有2只大鼠死亡，另外取2只CON組大鼠用于預(yù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)的第12周末行超聲心動(dòng)圖測定左心室功能。所有實(shí)驗(yàn)大鼠禁食24 h后稱體重，再斷頭處死。分別按實(shí)驗(yàn)要求取血、心用于觀察相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

2.2離體乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及分組實(shí)驗(yàn) 取出生1～2 d的乳鼠10只，用75%乙醇消毒皮膚，剪開胸部皮膚、開胸，用彎頭鑷子提取心臟，用無菌紗布吸干血液并剪取左心室，投入裝有預(yù)冷的50 mL D-Hanks液的離心管沖洗1次，用眼科剪將心肌組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，再用50 mL D-Hanks液沖洗3次，置37 ℃水浴箱內(nèi)，用含0.0225 g/L Liberase TH的D-Hanks液3 mL消化心肌組織10 min，每2～3 min吹打3～5次；靜置1～2 min后收集消化后的組織上清液到15 mL離心管，200×g、4 ℃ 離心5 min，去上清液后，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液3 mL懸起心肌細(xì)胞以終止消化。再重復(fù)消化心肌組織1次，共收集心肌細(xì)胞懸液6 mL。將6 mL心肌細(xì)胞懸液移至60 mm的培養(yǎng)皿，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱90 min，去掉大塊的雜質(zhì)和貼壁的成纖維細(xì)胞，將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管，懸勻細(xì)胞以5×108/L的細(xì)胞密度直接接種到用1%明膠處理過的12孔培養(yǎng)板。繼續(xù)置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，24 h后更換10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液，24 h后待細(xì)胞搏動(dòng)良好，開始分組實(shí)驗(yàn)。設(shè)低糖組、高糖組和EGB干預(yù)組，每組4孔。低糖組和高糖組分別用1%雙抗+10%胎牛血清+低糖DMEM和1%雙抗+10%胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)液，EGB干預(yù)組則用1%雙抗+10%胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)液+EGB，EGB濃度為100 mg/L。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS液清洗后按Trizol試劑說明書方法提取心肌細(xì)胞總RNA，后續(xù)RT-PCR實(shí)驗(yàn)見2.6。

2.3超聲心動(dòng)圖測定左心室功能 在實(shí)驗(yàn)的第12周末用水合氯醛(300 mg/kg,ip)麻醉大鼠，用帶有10 MHz探頭的超聲心動(dòng)圖儀檢測左心室功能,測量并計(jì)算左室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)= (LVEDV- LVESV)/LVEDV×100%和每搏射血量(stroke volume,SV)= LVEDV- LVESV。

2.4血糖、GHb及血胰島素水平測定 在實(shí)驗(yàn)第12周末行斷尾采血法，用Johnson穩(wěn)步倍加血糖儀測定大鼠血糖。斷頭處死大鼠，取3～4 mL全血，分別用比色法和放射免疫法分別測定GHb和血胰島素水平。檢測實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照測定試劑盒說明書操作。

2.5左心室重量指數(shù)的測量及光鏡標(biāo)本制備 處死大鼠前測量大鼠的體重。處死大鼠后,立即剪開胸腔取出心臟，分離左心室心肌，分別測量心臟和左心室的重量，左心室重量指數(shù)(left ventricular weight index,LVWI)=左心室的重量/體重。取心室部冠狀切面心肌組織，用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，制作切片，連續(xù)切片(厚5 μm)。每5張取1張，每個(gè)標(biāo)本均取6張切片，脫蠟，梯度乙醇至水。每個(gè)標(biāo)本取3張切片用于天狼星紅膠原纖維染色。具體步驟如下：1% Sirius red飽和苦味酸液1 h,自來水洗5 min,Mayer蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核1 min,自來水洗10 min,逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下膠原纖維陽性區(qū)染呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。另取3張切片用于TGF-β1EnVision 法免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，陽性區(qū)定位在細(xì)胞漿內(nèi)，呈黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，染色步驟具體按試劑說明書操作。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取4個(gè)視野攝像，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)分別測量平均膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的比及TGF-β1蛋白陽性區(qū)的平均積分吸光度。

2.6RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中TGF-β1、procollagen I 和collagen III mRNA表達(dá) 于-80 ℃冰箱取出心肌組織，按Trizol試劑說明書方法提取心肌組織總RNA。取1 μg進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。所用RT-PCR擴(kuò)增引物見表1(β-actin為內(nèi)參照)。每個(gè)前膠原蛋白分子的N端和C端分別含有1個(gè)前肽，成熟時(shí)前膠原蛋白分子經(jīng)胞吐作用被分泌至細(xì)胞外，受前膠原肽酶的作用，去除N端和C端的前肽，形成膠原。因此，collagen I的表達(dá)水平可以用心肌組織I型前膠原蛋白(procollagen I)水平表示。PCR變性、退火和延伸溫度分別為94 ℃、55 ℃和72 ℃,反應(yīng)時(shí)間分別為30 s、30 s和60 s,共35個(gè)循環(huán)。循環(huán)完畢再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片,然后用MUVB-20凝膠成像分析系統(tǒng)對每一標(biāo)本的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描,以β-actin灰度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn),數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。

表1 PCR產(chǎn)物長度大小及引物序列

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1超聲心動(dòng)圖測定左心室功能

與CON組大鼠相比，DM組大鼠的LVIDV和SV均顯著減少(P<0.01)。與DM組大鼠相比，EGB組大鼠LVIDV和SV均顯著增高(P<0.05)。但各組實(shí)驗(yàn)大鼠LVISV和LVEF比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

2體重、左心室重、左心室重量指數(shù)、血糖、GHb及血胰島素水平測定

與CON組大鼠相比，DM組大鼠體重、左心室重量及血胰島素水平均顯著降低,(P<0.01)，而左心室重量指數(shù)(P<0.01)、血糖(P<0.01)及GHb(P<0.05)則顯著增高；與DM組大鼠相比，EGB大鼠體重(P<0.01)、左心室重量(P<0.05)及血胰島素水平(P<0.05)均顯著增高,而左心室重量指數(shù)(P<0.05)、血糖(P<0.01)及GHb(P<0.05)則顯著降低, 見表3。

EGB:diabetic rats were treated with EGB.**P<0.01vscontrol (CON) group；#P<0.05vsdiabetes mellitus (DM) group.

表3體重、左心室重、左心室重量指數(shù)、血糖、糖基化血紅蛋白及血胰島素水平測定結(jié)果

Table 3. Body weight，left ventricular weight，left ventricle weight index，blood glucose，glycosylated hemoglobin and blood insulin levels(Mean±SD.n=8)

*P<0.05，**P<0.01vsCON group；#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

3光鏡觀察

天狼星紅染色結(jié)果：CON組大鼠的左心室心肌間大血管、小血管周圍和心肌質(zhì)間可見少許膠原纖維沉積。DM組大鼠的左心室組織內(nèi)見大小不等的血管周圍膠原纖維沉積更加明顯。EGB干預(yù)組大鼠左心室大小不等的血管周圍膠原纖維沉積。用Image-Pro Plus 5.0圖像處理系統(tǒng)測量膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的面積比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與CON組相比較，DM組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多(P<0.05)；與DM組相比較，EGB組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The results of Sirius red staining of rat left ventricular myocardial tissues in each group (×400).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsDM group.

圖1各組大鼠左心室心肌天狼猩紅染色結(jié)果

TGF-β1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果： CON組和EGB組大鼠的左心室心肌細(xì)胞漿內(nèi)見淡黃色，而DM組大鼠的左心室心肌細(xì)胞呈深黃色。用Image-Pro Plus 5.0圖像處理系統(tǒng)分別測量TGF-β1的平均積分吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與CON組相比較，DM組大鼠心肌細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與DM組相比較，EGB組大鼠心肌細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)明顯減少，差異顯著(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The results of immunohistochemical analysis of TGF-β1protein in the left ventricular myocardial tissues of each group (×400).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsDM group.

圖2各組大鼠左心室心肌TGF-β1蛋白免疫組織化學(xué)表達(dá)分析結(jié)果

4在體心肌組織RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與CON組相比較，DM組大鼠心肌組織procollagen I、collagen III和TGF-β1mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與DM組相比較，EGB組大鼠心肌組織Procollagen I、collagen III和TGF-β1mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The results of RT-PCR analysis of rat left ventricular myocardial tissues of each groupinvivo.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsDM group.

圖3各組大鼠左心室心肌組織RT-PCR分析結(jié)果

5離體心肌細(xì)胞RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與LG組相比，HG組大鼠心肌細(xì)胞procollagen I、collagen III和TGF-β1mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與HG組相比較，HG+EGB組大鼠心肌細(xì)胞procollagen I、collagen III和TGF-β1mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The results of RT-PCR analysis of neonatal rat cardiomyocyocytes.Cardiomytes were treated with low-glucose (LG) DMEM,high-glucose (HG) DMEM or HG in combination with EGB for 24 h. Expression of procollagen I, collagen III and TGF-β1mRNA was examined. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsLG group;##P<0.01vsHG group.

圖4離體大鼠左心室心肌細(xì)胞RT-PCR分析結(jié)果

討 論

DCM是以心肌細(xì)胞肥大、凋亡、間質(zhì)纖維化和血管壁增厚為特征的心肌病[4]，是糖尿病晚期致死的主要并發(fā)癥之一。研究表明：實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞的損傷和糖尿病病人的心臟病變過程基本一致。糖尿病大鼠舒張功能的異常和被動(dòng)充盈受損被認(rèn)為是左心室功能異常的早期征象之一[5-6]。目前糖尿病心肌病缺乏有效的治療措施，尋求早期干預(yù)藥物，預(yù)防或減緩糖尿病心肌纖維化的進(jìn)展并改善心功能是糖尿病心肌病研究的熱點(diǎn)之一。

糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來，糖尿病心臟非心肌細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)和細(xì)胞外基質(zhì)(主要成分是心肌間質(zhì)膠原)在糖尿病心肌病心室重構(gòu)中的作用倍受關(guān)注。心肌纖維化是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)，而心肌纖維化表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解之間的失衡，心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高或膠原容積分?jǐn)?shù)顯著增高，其中主要是collagen I和 collagen III明顯增多[7-8]。我們通過建立STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：12周時(shí)DM組大鼠體重、左心室重量、血胰島素水平均顯著下降；而血糖、糖化血紅蛋白和左心室重量指數(shù)則顯著增高。超聲心動(dòng)圖檢測左心室功能，發(fā)現(xiàn)DM組大鼠的LVIDV和SV均顯著減少。天狼星紅染色顯示糖尿病大鼠左心室心肌間質(zhì)及血管周膠原纖維明顯增多，RT-PCR檢測 procollagen I和collagen III mRNA 表達(dá)明顯增高。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示：STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在12周時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了左心室心臟肥大，舒張功能的降低，左心室泵血功能的異常及心肌間質(zhì)纖維化。這結(jié)果和Chen等[9]研究的結(jié)果一致。糖尿病大鼠左心室舒張功能降低、泵血功能異常與其心肌間質(zhì)纖維化有關(guān)[10-11]。EGB干預(yù)治療后，糖尿病大鼠的體重增加，血清相應(yīng)的指標(biāo)改善，左心室重量指數(shù)下降，LVIDV和SV升高，左心室心肌組織內(nèi)procollagen I和collagen III mRNA 表達(dá)降低，同時(shí)左心室心肌間質(zhì)及血管周膠原纖維的沉積明顯減少。這提示EGB能減輕心肌細(xì)胞肥大及心肌間質(zhì)纖維化，進(jìn)而改善糖尿病大鼠左心室的舒張及泵血功能。因此，我們認(rèn)為EGB不僅能改善糖尿病大鼠血糖、GHb及胰島素水平，同時(shí)也能減輕糖尿病心肌病大鼠心肌間質(zhì)纖維化，改善糖尿病大鼠左心室的舒張及泵血功能。

在糖尿病機(jī)體中引起心肌間質(zhì)纖維化的因素眾多，其中TGF-β1被公認(rèn)為促誘發(fā)心肌纖維化的最重要的因子之一，而且TGF-β1是諸多因素所致心肌纖維化的共同通路[12-13]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠12周時(shí)左心室心肌組織內(nèi)TGF-β1mRNA和蛋白高表達(dá)，并與左心室心肌組織內(nèi)collagen I，和collagen III的表達(dá)增高相對應(yīng)。提示糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1可能參與心肌纖維化的病理發(fā)生、發(fā)展過程。這可能是糖尿病機(jī)體內(nèi)血糖升高、氧化應(yīng)激及糖基化終末產(chǎn)物增多、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活等可促使心肌細(xì)胞及其間質(zhì)細(xì)胞分泌TGF-β1。TGF-β1的作用由活化型TGF-β1受體介導(dǎo)，使心肌成纖維細(xì)胞合成膠原纖維蛋白、纖維黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)，激活的TGF-β1可抑制蛋白水解酶的表達(dá)，抑制纖溶酶原、膠原酶基質(zhì)酶原等酶激活物的產(chǎn)生，最終減少ECM的降解，使ECM在細(xì)胞間沉積，最終導(dǎo)致心肌纖維化[14-15]。 EGB干預(yù)治療后，糖尿病大鼠左心室心肌組織內(nèi)TGF-β1mRNA 及其蛋白表達(dá)降低，同時(shí)左心室心肌間質(zhì)及血管周膠原纖維的沉積減少，左心室心肌組織內(nèi)procollagen I和collagen III mRNA 表達(dá)降低。這提示EGB可能是通過TGF-β1通路減輕糖尿病大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)的纖維化，進(jìn)而改善左心室的舒張功能。為排除EGB在體內(nèi)代謝及其他作用的影響，我們在體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，并用高糖及EGB干預(yù)。發(fā)現(xiàn)高糖能刺激心肌細(xì)胞TGF-β1、Procollagen I和collagen III的mRNA表達(dá)；EGB能降低高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞的TGF-β1、procollagen I和collagen III mRNA表達(dá)。因此，我們認(rèn)為TGF-β1參與糖尿病大鼠心肌纖維化的病理發(fā)生、發(fā)展的過程；EGB通過減少糖尿病大鼠TGF-β1在心肌中的表達(dá),抑制膠原的形成和心肌間質(zhì)纖維化,這可能是EGB改善心室重塑的機(jī)制之一。當(dāng)然，糖尿病心肌病的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，EGB保護(hù)糖尿病心肌的機(jī)制有待進(jìn)一步的明確。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過在體、離體糖尿病模型實(shí)驗(yàn),表明TGF-β1參與糖尿病心肌病大鼠心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的病理過程；EGB能通過有效調(diào)低心肌TGF-β1的表達(dá)，減少心肌間質(zhì)纖維化可能是EGB防治糖尿病心肌病的重要機(jī)制之一。

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EffectsofGinkgobilobaextractonmyocardialTGF-β1andcollagenexpressionandinterstitialfibrosisintypeIdiabeticcardiomyopathyrats

LIU Gen-lin1, YUAN Feng-ju2, LU Ci-li3, ZHAO Jing4, JIN Ke-ke4, TIAN Xin-qiao5, QIU Qiao-meng1, LI Jian-min2

(1DepartmentofEmergency,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,3FacultyofPreventiveMedicine,SchoolofEnviomentalScienceandHealth,4DepartmentofPathophysiology,5DepartmentofUltrasonicImaging,theSecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:wzyxyljmin@163.com;qqm@wzhospital.cn)

AIM: To study the effects ofGinkgobilobaextract (EGB) on myocardial TGF-β1and collagen expression and interstitial fibrosis in type I diabetic cardiomyopathy rats.METHODSThirty male SD rats were randomly divided into normal control group (CON), diabetes mellitus group (DM) and EGB treatment group (EGB). Streptozocin was intraperitoneally injected into the animals in the latter 2 groups to induce type I diabetic rat model. The rats in EGB group were intraperitoneally injected with EGB. At the end of the 12th week, the body weight of each rat and its left ventri-cular weight, blood glucose, glycosylated hemoglobin and serum insulin concentration were measured. The left ventricular end-diastolic volume (LVEDV), the left ventricular end-systolic volume (LVESV), the left ventricular ejection fraction (LVEF) and the stroke volume (SV) were determined by echocardiography. The content of collagen in left ventricular myocardium, and the expression of transforming growth factor β1(TGF-β1), procollagen type I and collagen type III were assayed by Sirius red staining, immunohistochemical staining and RT-PCR, respectively. Left ventricular myocardial cells of the neonatal SD rats were isolated and culturedinvitrowith low-glucose culture medium (LG group), high-glucose culture medium (HG group) or high-glucose culture medium plus EGB (HG+EGB group). The mRNA levels of TGF-β1, procollagen type I and collagen type III were detected by RT-PCR.RESULTSCompared with CON group, blood glucose, glycosylated hemoglobin, left ventricular weight index, the content of collagen, and the expression of TGF-β1, procollagen type I and collagen type III in left ventricular myocardial tissues of DM group were significantly increased, while the levels of blood insulin, LVEDV and SV were significantly decreased. However, compared with DM group, blood glucose, glycosylated hemoglobin, left ventricule weight index, the content of collagen, and the expression levels of TGF-β1, procollagen type I and collagen type III in the left ventricular myocardial tissues of EGB-treated rats were significantly decreased, while the levels of blood insulin, LVEDV and SV were significantly increased. Compared with LG group, the mRNA expression levels of TGF-β1, procollagen type I and collagen type III were significantly increased. However, compared with HG group, the mRNA expression levels of TGF-β1, procollagen type I and collagen type III were significantly decreased after treated with EGB.CONCLUSIONEGB retards the process of myocardial fibrosis and improves the cardiac functions in type I diabetic cardiomyopathy rats by down-regulating the expression of TGF-β1, reducing the synthesis and deposition of collagen type I and collagen type III.

Diabetes mellitus; Extract ofGingkobiloba; Myocardial fibrosis

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.018

1000- 4718(2013)11- 2017- 07

2013- 06- 26

2013- 09- 10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170204)

△通訊作者 李劍敏 Tel: 0577-55579792； E-mail: wzyxyljmin@163.com; 邱俏蒙 Tel: 0577-55579016； E-mail: qqm@wzhospital.cn