鄭旭浩， 張小磊， 江立波， 胡旭琪， 金永龍， 鄭亦靜， 吳 畏， 徐華梓

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院脊柱外科，浙江 溫州 325000)

細胞自噬在糖尿病大鼠椎間盤退變中的作用*

鄭旭浩， 張小磊， 江立波， 胡旭琪， 金永龍， 鄭亦靜， 吳 畏， 徐華梓△

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院脊柱外科，浙江 溫州 325000)

目的探討凋亡和自噬水平在糖尿病大鼠椎間盤髓核組織中的變化及其作用。方法SD大鼠注射鏈脲佐菌素(STZ)復制糖尿病模型16周后，完整獲取大鼠腰椎間盤，經(jīng)石蠟包埋切片、蘇木素-伊紅(HE)染色和阿里新藍染色，在組織水平檢測椎間盤病理變化。DNA原位末端標記法(TUNEL)檢測髓核細胞凋亡率，免疫組織化學及Western blotting方法檢測髓核組織凋亡和自噬水平。結果HE和阿里新藍染色顯示糖尿病大鼠椎間盤發(fā)生退變。和正常組相比，caspase-3陽性細胞比例在糖尿病大鼠椎間盤中明顯增加。TUNEL結果顯示糖尿病大鼠椎間盤髓核細胞凋亡率升高。Western blotting和免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)自噬指標LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1表達量在糖尿病大鼠組均高于正常組。結論STZ誘導的糖尿病可加速大鼠椎間盤退變，并且提高了髓核組織中凋亡和自噬水平。

椎間盤退變； 糖尿?。?自噬； 細胞凋亡

椎間盤退變是下腰痛的重要誘因，長期的下腰痛導致生活質(zhì)量的下降。糖尿病是以血糖升高為主要表現(xiàn)，并伴隨一系列并發(fā)癥的慢性代謝性疾病，目前其發(fā)病率呈快速上升趨勢。最近的研究顯示糖尿病與椎間盤退變密切相關，有研究表明，糖尿病可能是腰椎管狹窄的危險因素[1]。一項包含200位患者的前瞻性研究表明，糖尿病和其它疾病相比，其伴發(fā)腰椎病變的幾率明顯增加[2]。然而，糖尿病引起椎間盤退變的機制目前仍不清楚。Won等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠椎間盤退變提早，其髓核細胞凋亡率升高，而髓核細胞凋亡升高是椎間盤退變的重要危險因素。自噬，作為另一種細胞程序性死亡方式，在人類疾病的病理過程中，與凋亡發(fā)生密切相關[4]。自噬可以在細胞應激時，通過溶酶體途徑消化轉變內(nèi)源性的細胞器、分子實現(xiàn)對細胞的保護作用。Ye等[5]的研究表明，大鼠椎間盤發(fā)生退變時，自噬水平升高。而糖尿病對椎間盤自噬影響目前尚少有研究。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)是一種針對胰島β細胞特異性細胞毒性物質(zhì)，有致糖尿病作用，目前廣泛應用在糖尿病模型的建立上。在本實驗中采用STZ誘導建立大鼠糖尿病模型，對糖尿病大鼠椎間盤在組織學水平進行研究，檢測糖尿病對椎間盤退變的影響，然后檢測糖尿病大鼠椎間盤凋亡和自噬水平變化，進一步探討糖尿病對椎間盤的影響，從而為糖尿病伴發(fā)椎間盤退變提供新的治療思路。

材 料 和 方 法

1動物

健康雄性清潔級(SPF)2月齡SD大鼠40只，體重300～340 g，購自上海實驗動物中心，有關動物實驗的相關內(nèi)容通過了溫州醫(yī)科大學倫理委員會的審批。

2材料

鏈脲佐菌素(Sigma)，快速血糖儀(Roche)，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(索來寶)，阿里新藍試劑(Sigma)，caspase-3抗體、LC3抗體、beclin-1抗體和β-actin抗體(Cell Signal Techno-logy)，辣根過氧化酶標記抗體(康為世紀)，TUNEL凋亡試劑盒(Roche)，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、SDA-PAGE凝膠配制試劑盒和蛋白酶抑制劑(碧云天)，ECL發(fā)光液(Invitrogen)。

3主要方法

3.1SD大鼠糖尿病模型 清潔級SD大鼠全部飼養(yǎng)在全屏障清潔級動物實驗房內(nèi)，并于實驗前適應環(huán)境1 周。實驗動物隨機分為2組，即糖尿病組(20只)和正常組(20只)，將STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液中(pH 4.0～4.4)配成1%STZ溶液。糖尿病組按照65 mg/kg的劑量腹腔注射1% STZ溶液，正常組給予等量0.1 mol/L檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。所有大鼠完成注射后，2組給予相同的生活環(huán)境和喂養(yǎng)條件。在注射STZ前及注射后3 d、7 d和16 周，使用快速血糖儀對大鼠尾靜脈血進行空腹血糖測量。在注射后7 d，只有空腹血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠才繼續(xù)保留在實驗組，視為糖尿病大鼠造模成功。完成注射后，每周定期測量大鼠體重。完成注射后16 周，大鼠被處以安樂死，完整獲取腰椎椎間盤，取部分用10%甲醛固定后，10%EDTA溶液脫鈣，石蠟包埋后切片，切片厚4 μm。剩余腰椎間盤迅速置于液氮中速凍后，轉至-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)Western blotting檢測。

3.2HE和阿里新藍染色 用HE染色觀察椎間盤組織病理變化，用阿里新藍染色觀察細胞外基質(zhì)中蛋白聚糖變化(阿里新藍染液可以將蛋白聚糖染成藍色)。HE染色步驟按照HE染色試劑盒說明書步驟進行：切片置二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染液染色5 min，自來水沖洗，分化液分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅染液染2 min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。阿里新藍染色步驟：切片置二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，1%阿里新藍染液(以3%冰醋酸為溶劑)37 ℃染色30 min，然后用0.1%核固紅染液(以5%硫酸鋁溶液為溶劑)室溫染色20 min，流水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

3.3TUNEL檢測凋亡 切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，按照Roche TUNEL試劑盒的說明進行操作，37 ℃下蛋白酶K濕孵15 min，3%雙氧水室溫孵育5 min滅活內(nèi)源性酶，按1∶9現(xiàn)配的酶溶液和熒光標記液混合后，按照每張切片50 μL滴加混合液，37 ℃避光濕孵1 h，熒光顯微鏡下觀察。

3.4免疫組織化學 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%雙氧水室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性酶, 用胰蛋白酶37 ℃孵育30 min 修復抗原, 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫下封閉30 min，滴加Ⅰ抗(均1∶100)，4 ℃孵育過夜，最后用辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

3.5Western blotting 用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液提取髓核組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE蛋白加樣后電泳，將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h后，孵caspase-3抗體(1∶1 000)、LC3抗體(1∶500)、beclin-1抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，孵育辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗(1∶3 000)室溫下2 h，ECL發(fā)光液顯色。

4統(tǒng)計學處理

使用SPSS 18統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用獨立樣本t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1血糖、體重變化

注射STZ溶液7 d以后，糖尿病組大鼠血糖濃度明顯升高[(20.3±1.4) mmol/L]，與正常組相比[(5.9±0.8) mmol/L]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。16 周時，糖尿病組血糖濃度[(22.2±1.9) mmol/L]相對于正常組[(6.4±0.7) mmol/L]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。糖尿病組大鼠體重(313 g±33 g)比正常組(514 g±22 g)明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2糖尿病大鼠椎間盤發(fā)生退變

HE染色顯示(圖1)，糖尿病大鼠椎間盤脊索細胞減少，出現(xiàn)類軟骨細胞；纖維環(huán)呈蜿蜒狀排列，髓核基質(zhì)排列紊亂、減少，髓核及纖維環(huán)向外膨出；部分髓核細胞排列成簇，這是椎間盤退變的標志[6]。而正常組，椎間盤纖維環(huán)排列整齊，髓核與纖維環(huán)分界清楚，髓核細胞豐富，基質(zhì)充實(圖1)。阿里新藍將蛋白聚糖染成淺藍色(圖1)，結果與HE染色相符。相對于正常組，糖尿病大鼠椎間盤蛋白聚糖含量明顯減少，提示椎間盤發(fā)生退變。

Figure 1. Morphological changes of the intervertebral discs (HE and alcian blue staining).

圖1椎間盤的形態(tài)學變化

3糖尿病大鼠椎間盤髓核細胞凋亡增加

TUNEL熒光顯示，糖尿病大鼠椎間盤髓核凋亡細胞數(shù)明顯高于正常組(圖2A、C)。免疫組化檢測凋亡指標caspase-3發(fā)現(xiàn)，糖尿病組caspase-3陽性細胞明顯增多(圖2A)。同時，Western blotting檢測結果顯示，糖尿病組caspase-3條帶灰度高于正常組(圖2B、D)。以上結果均表明，糖尿病促進大鼠髓核細胞凋亡。

4糖尿病大鼠椎間盤髓核細胞自噬水平升高

免疫組化檢測LC3發(fā)現(xiàn)，陽性細胞主要出現(xiàn)在椎間盤髓核中，而且，糖尿病組陽性細胞表達明顯高于正常組(圖3A)。Western blotting檢測LC3和beclin-1，結果顯示糖尿病組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1/β-actin的比值明顯大于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(圖3B、C,P<0.05)。LC3和beclin-1是自噬的相對特異性指標，當自噬增強時，它們的表達量會增加，尤其是LC3，當自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ發(fā)生轉化。LC3Ⅱ定位于自噬前體和自噬體，參與自噬體的形成，為自噬的標志分子之一。以上結果表明，糖尿病大鼠髓核組織中自噬增強，糖尿病是誘導大鼠髓核細胞自噬的一個因素。

Figure 2. Apoptosis of the intervertebral discs.A: immunohistochemistry for caspase-3 (×400) and TUNEL staining (×200); B: Western blotting for caspase-3; C: the number of TUNEL positive cells;D: the ratio of activated caspase-3 to caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group

圖2椎間盤細胞凋亡的觀察

Figure 3. Autophagy of the intervertebral discs.A: immunohistochemistry for LC3 (×400); B: Western blotting for LC3 and beclin-1; C: quantitative analysis of LC3Ⅱ to LC3Ⅰand beclin-1 to β-actin.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group.

圖3椎間盤細胞自噬的觀察

討 論

本實驗通過HE染色和阿里新藍染色，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠椎間盤纖維環(huán)排列紊亂，髓核基質(zhì)丟失，蛋白聚糖表達減少，髓核及纖維環(huán)向外膨出；并且TUNEL和免疫組化顯示，糖尿病大鼠較正常組椎間盤凋亡水平明顯升高，椎間盤退變加速。椎間盤處于一個封閉的環(huán)境中，其營養(yǎng)通路主要有2條：一是終板途徑，椎體內(nèi)血管的營養(yǎng)物質(zhì)通過骨髓腔、血竇、軟骨終板界面逐層擴散到椎間盤，營養(yǎng)髓核及纖維環(huán)內(nèi)層；二是纖維環(huán)途徑，即纖維環(huán)表面血管營養(yǎng)纖維環(huán)外層。因此，當椎間盤周圍微血管發(fā)生病變時，椎間盤營養(yǎng)供應不足，極易發(fā)生椎間盤退變[7]。而糖尿病極易引起周圍微血管病變[8]，引起糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病等。由此我們推測，糖尿病可能引起椎間盤周圍微血管發(fā)生狹窄，進而導致椎間盤營養(yǎng)供應下降和代謝廢物交換障礙，而椎間盤營養(yǎng)供應下降又可引起髓核細胞凋亡率的升高[9]，影響椎間盤細胞合成和維持細胞外基質(zhì)分泌的能力，細胞外基質(zhì)如蛋白聚糖、膠原蛋白分泌減少，從而加速椎間盤退變。

自噬在細胞和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，在生理情況下，自噬是機體在應激狀態(tài)下的一種防御措施，可以應對如營養(yǎng)匱乏、氧化應激和低氧等代謝應激，通過消化自身細胞器、清除代謝廢物，獲得營養(yǎng)物質(zhì)和能量，適應應激，發(fā)揮保護作用，是細胞維持穩(wěn)態(tài)的一種重要機制[10]。本實驗通過Western blotting檢測自噬相關蛋白LC3和beclin-1在髓核細胞中的表達，以及免疫組化檢測LC3陽性細胞的比例，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠椎間盤髓核組織自噬水平，相比正常組明顯升高了。糖尿病大鼠髓核組織自噬水平增強，提示糖尿病可能是引起自噬升高的刺激因素。糖尿病引起椎間盤周圍微血管發(fā)生狹窄，導致椎間盤營養(yǎng)供應下降。Shirazi-Adl等[11]對椎間盤模型的觀察中發(fā)現(xiàn)，遠離血供的近中央髓核區(qū)域最易受血供不足的影響。因此，發(fā)生糖尿病時，位于內(nèi)層的髓核細胞長期處于低營養(yǎng)饑餓應激狀態(tài)，細胞通過自噬降解蛋白質(zhì)和細胞器為自身提供能量和營養(yǎng)。這與免疫組化的結果相符：自噬主要出現(xiàn)在椎間盤髓核中。本課題組的前期研究表明[12]在髓核細胞處于低營養(yǎng)饑餓環(huán)境時，細胞自噬水平升高；而且，細胞自噬對饑餓環(huán)境下髓核細胞具有保護作用，可以減少髓核細胞凋亡的發(fā)生。因此，作者認為，自噬可能是椎間盤髓核細胞針對糖尿病時發(fā)生的應激性自我保護反應，自噬在糖尿病椎間盤髓核組織中發(fā)揮保護作用。

凋亡和自噬在生化代謝途徑和形態(tài)學上均存在明顯區(qū)別，凋亡又稱為Ⅰ型細胞程序性死亡，依賴caspase的參與，具有細胞核固縮、碎裂、DNA降解、凋亡小體形成等特征。自噬性死亡又稱為Ⅱ型細胞程序性死亡，通過形成雙層膜結構包裹胞漿內(nèi)物質(zhì)，如蛋白及細胞器，最終通過溶酶體途徑被清除，它是一個非依賴caspase的過程[13]。但越來越多的證據(jù)表明，凋亡和自噬在某些方面存在緊密聯(lián)系。例如自噬相關蛋白Atg5可通過與Fas相關死亡域蛋白相互作用引起細胞自噬死亡[14]，凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2可與自噬基因beclin-1結合從而調(diào)節(jié)自噬[15]。p53作為有效的凋亡誘導因子，可以通過增強損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控基因(damage-regulated autophagy modulator,DRAM)的表達而直接誘導自噬[16]。因此，我們認為細胞自噬和凋亡是兩種相互聯(lián)系而密不可分的死亡方式。自噬可以通過抑制凋亡發(fā)揮對細胞的保護作用[17]，自噬是如何抑制凋亡的發(fā)生目前仍不清楚，一種解釋是自噬可以吞噬包裹受損的線粒體，防止細胞色素C的釋放，從而避免細胞凋亡的發(fā)生[17]。糖尿病大鼠椎間盤髓核組織中凋亡和自噬水平均升高。糖尿病的一個主要表現(xiàn)是高糖，高糖代謝過程中產(chǎn)生大量的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)，AGE促進氧自由基的生成[18]，產(chǎn)生氧化應激，損傷線粒體并引起細胞凋亡。AGE作用下，細胞的自噬被激活[19]，用于清除AGE引起的一些損傷細胞器和代謝產(chǎn)物，延緩凋亡發(fā)生，從而發(fā)揮保護作用。因此，AGE可能是糖尿病中引起凋亡和自噬的誘因。

自噬是把“雙刃劍”，基礎性的自噬廣泛存在于細胞正常的生理過程中，有修復細胞和維持細胞生命的作用，在缺氧、炎癥、代謝障礙時，細胞可以通過增強自噬清除細胞內(nèi)受損的細胞器、代謝產(chǎn)物而發(fā)揮保護作用，而過量的自噬會導致細胞自噬性死亡[20]。因此，如何適度地調(diào)節(jié)自噬水平，以發(fā)揮自噬的保護作用，是我們今后研究的重點。

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Roleofautophagyinintervertebraldiscdegenerationindiabeticrats

ZHENG Xu-hao, ZHANG Xiao-lei, JIANG Li-bo, HU Xu-qi, JIN Yong-long, ZHENG Yi-jing, WU Wei, XU Hua-zi

(DepartmentofSpineSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:spinexu@163.com)

AIM: To explore the levels of apoptosis and autophagy in the nucleus pulposus tissues of intervertebral discs in diabetic rats.METHODSSixteen weeks after injection of streptozocin (STZ), the lumbar intervertebral discs were obtained from the rats. The histological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining and alcian blue staining. The apoptosis of the nucleus pulposus cells was measured by the methods of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL), immunohistochemistry, and Western blotting. The level of autophagy in the nucleus pulposus cells was detected by Western blotting and immunohistochemistry.RESULTSCompared with normal group, HE and alcian blue staining suggested that the intervertebral discs of the diabetic rats became degenerate. The expression of caspase-3 and the apoptotic rate were increased in intervertebral disc nucleus pulposus of the diabetic rats. The results of immunohistochemistry and Western blotting showed that the expression levels of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand beclin-1 in the diabetic rats were higher than those in normal group.CONCLUSIONThe STZ-induced diabetes accelerates degeneration of the intervertebral discs. In addition, the apoptosis and autophagy are increased in the intervertebral discs of diabetic rats.

Intervertebral disc degeneration; Diabetes mellitus; Autophagy; Apoptosis

R329.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.017

1000- 4718(2013)11- 2011- 06

2013- 07- 14

2013- 10- 16

浙江省“重中之重”學科開放基金資助項目(No. 2011GK001)

△ 通訊作者 Tel: 0577-88002854； E-mail: spinexu@163.com