陳淑芬， 侯婧瑛， 吳淑云， 王凌云△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2急診科，廣東 廣州 510120)

IFN-γ上調(diào)人胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)*

陳淑芬1， 侯婧瑛2， 吳淑云1， 王凌云1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科，2急診科，廣東 廣州 510120)

目的研究不同人胃癌細(xì)胞株表面程序性死亡配體1(PD-L1)表達(dá)及干擾素γ(IFN-γ)對其表達(dá)的誘導(dǎo)情況。方法分別培養(yǎng)不同人胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901，經(jīng)不同濃度IFN-γ、作用不同時間后，利用流式細(xì)胞術(shù)及real-time PCR檢測胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)顯示AGS、BGC823、MGC803和SGC7901細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)率分別為(1.567±0.109)%、(2.640±0.577)%、(1.760±0.236)%和(16.030±1.289)%；不同胃癌細(xì)胞株對IFN-γ反應(yīng)不同，經(jīng)不同濃度IFN-γ刺激后均可不同程度上調(diào)PD-L1的表達(dá)(P<0.05)；real-time PCR顯示10 μg/L IFN-γ刺激各胃癌細(xì)胞株12 h后PD-L1 mRNA水平上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論胃癌細(xì)胞株組成性表達(dá)PD-L1；IFN-γ可上調(diào)胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1的表達(dá)，呈現(xiàn)濃度、時間依賴性；其中以SGC7901細(xì)胞(來源于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié))表達(dá)最高，推測胃癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與腫瘤分化程度無關(guān)，與組織來源和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；IFN-γ上調(diào)胃癌細(xì)胞PD-L1，表明IFN-γ并非都是抑制腫瘤增殖、生長，可能參與介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，故臨床運(yùn)用IFN-γ輔助治療胃癌時應(yīng)慎用。

胃癌細(xì)胞； 程序性死亡配體1； 干擾素γ； 預(yù)后

程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, 簡稱PD-L1，又稱為B7-H1)，是一種含有290個氨基酸的I型跨膜糖蛋白，于1997年被Dong等[1]從胎盤cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)。PD-L1蛋白廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、活化T/B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內(nèi)皮和胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞。在許多腫瘤組織亦有PD-L1蛋白的表達(dá)，如宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌[2-3]，且腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高,與患者臨床預(yù)后緊密相關(guān)[1,4]。胃癌是常見且惡性程度較高的消化道惡性腫瘤，手術(shù)是首選治療方法，然而術(shù)后患者預(yù)后差，5年總生存率僅約30%～50%，術(shù)后聯(lián)合免疫治療和/或化療方案有著較為肯定的療效。干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)因其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能的作用而廣泛用于腫瘤治療。近年研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌PD-L1表達(dá)[2,5]。目前國內(nèi)外關(guān)于胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)及IFN-γ對其表達(dá)影響的研究及報(bào)道較少。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)及實(shí)時熒光定量RT-PCR分析不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)，并探討IFN-γ能否上調(diào)不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)，以期為胃癌的綜合治療方案提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院黃開紅教授惠贈；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)基均購于HyClone；IFN-γ購于Peprotech；PE標(biāo)記抗人PD-L1抗體和PE標(biāo)記小鼠IgG1同型抗體均購于eBioscience。Trizol和TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 均購于寶生生物公司，SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix購于華南地區(qū)Bio-Rad總代理；FACS流式細(xì)胞儀為BD產(chǎn)品。CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀為Bio-Rad產(chǎn)品。

2方法

2.1不同濃度IFN-γ對胃癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 待體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞處于生長對數(shù)期時，消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×108/L，接種于24孔板培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度IFN-γ(0 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L和80 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞。每次設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.2IFN-γ刺激不同胃癌細(xì)胞株不同時點(diǎn)PD-L1表達(dá) 取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，接種于24孔板，實(shí)驗(yàn)組加10 μg/L[5-6]IFN-γ，分別培養(yǎng)不同時間(0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h)，每個時點(diǎn)設(shè)置3個復(fù)孔，收獲各時段細(xì)胞。重復(fù)3次。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集上述處理細(xì)胞，0.02%EDTA消化，離心，1 000 r/min 5 min，PBS(含1%FBS)洗滌2次；PBS(含1%FBS)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L；各吸取100 μL細(xì)胞懸液，分為2管，分別加入PE標(biāo)記小鼠IgG1和PE標(biāo)記鼠抗人 PD-L1抗體1 μL，混勻置于4 ℃避光孵育30 min，2 mL PBS洗滌1次，300 μL PBS重懸，上機(jī)檢測。

2.4Real-time PCR 細(xì)胞懸液接種于6孔板，10 μg/L IFN-γ干預(yù)12 h，據(jù)TaKaRa Total RNA說明書提取總RNA，-80℃保存；按TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 說明書合成cDNA， -20℃保存；引物設(shè)計(jì)合成由Life Invitrogen 公司完成。β-actin正義序列5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，反義序列5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；PD-L1正義序列 5’-GGACAAGCAGTGACCATCAAG-3’，反義序列5’-CCCAGAATTACCAAGTGAGTCCT-3’。按照Bio-Rad SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix說明書實(shí)驗(yàn)。體系為20 μL，取2 μL cDNA產(chǎn)物分別與PD-L1引物和β-actin引物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重復(fù)40次循環(huán)。Bio-Rad CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀操作反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔCt。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間多重比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均表達(dá)PD-L1

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示不同胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均不同程度表達(dá)PD-L1(與標(biāo)記同型抗體的胃癌細(xì)胞株相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P<0.05)；其中以SGC7901表達(dá)最高[(16.030±1.289)%]，余依次為BGC823、MGC803和AGS,見圖1。

2胃癌細(xì)胞經(jīng)IFN-γ刺激后呈現(xiàn)劑量和時間依賴性上調(diào)PD-L1蛋白表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均可經(jīng)不同濃度IFN-γ刺激后上調(diào)PD-L1，并呈現(xiàn)劑量依賴性：隨著IFN-γ濃度升高，PD-L1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2；在10 μg/L IFN-γ刺激不同時間后，不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢，48 h達(dá)高峰，72 h后開始下降，其中BGC823、MGC803和SGC7901表達(dá)與0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。不同胃癌細(xì)胞株對IFN-γ的反應(yīng)敏感性不同，以BGC823和SGC7901較為敏感，低濃度(5 μg/L和10 μg/L)IFN-γ即可上調(diào)PD-L1表達(dá)(P<0.05)，而細(xì)胞株AGS和MGC803則需要中濃度(40 μg/L)和高濃度(80 μg/L)IFN-γ上調(diào)PD-L1表達(dá)(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. PD-L1 surface expression in four different human gastric cancer cell lines analysed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsisotype control.

圖1不同胃癌細(xì)胞株表面PD-L1的表達(dá)

Figure 2. Dose-dependent surface expression of PD-L1 in human gastric cancer cells induced by IFN-γ. AGS,BGC823, MGC803 and SGC7901 cells were treated with diffenrent concentrations of IFN-γ for 24 h. PD-L1 surface expression was analysed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L.

圖2不同濃度IFN-γ對不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的影響

Figure 3. Time-dependent surface expression of PD-L1 in human gastric cancer cells induced by IFN-γ. Human gastric cancer cell lines AGS,BGC823,MGC803 and SGC7901 were treated with IFN-γ (10 μg/L) for diffenrent time. PD-L1 surface expression was analysed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

圖3IFN-γ作用不同時間對不同胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的影響

3IFN-γ上調(diào)胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示10 μg/L IFN-γ刺激胃癌細(xì)胞12 h，各種胃癌細(xì)胞PD-L1 mRNA水平均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以SGC7901細(xì)胞最明顯，見圖4。

討 論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，根治性手術(shù)是治療的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。據(jù)調(diào)查，我國胃癌的發(fā)病率及死亡率均高于世界水平[7]。提高生存率，改善患者預(yù)后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)陽性的胃癌患者其1年、3年生存率均低于表達(dá)陰性者，術(shù)后PD-L1可明顯下降，而復(fù)發(fā)時升高[3]。高表達(dá)PD-L1的腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯升高，無病生存率及總生存率均明顯低于PD-L1陰性或低表達(dá)者[4]。故目前PD-L1已被公認(rèn)可作為評估腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素[4,8-9]。我們前期通過免疫組化發(fā)現(xiàn)胃癌組織表達(dá)PD-L1，PD-L1表達(dá)陽性者與表達(dá)陰性組的1年生存率上未見明顯差異，而3年生存率存在差異性，表達(dá)陽性組較陰性組3年生存率相對較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(未發(fā)表)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR技術(shù)分別從蛋白及mRNA水平檢測各胃癌細(xì)胞株中PD-L1表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803和SGC7901均組成性表達(dá)PD-L1。實(shí)驗(yàn)選用不同分化程度、不同來源的胃癌細(xì)胞系(AGS和BGC823均為低分化胃腺癌，MGC803為低分化胃黏液腺癌，SGC7901為中分化胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶)，以SGC7901細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)最高，考慮可能與其來源于胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，而PD-L1高表達(dá)于活化淋巴細(xì)胞有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PD-L1的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度無直接關(guān)系，而可能與胃癌細(xì)胞組織來源及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

Figure 4. PD-L1 relative mRNA expression stimulated with IFN-γ in four different gastric cancer cell lines. The gastric cancer cell lines AGS,BGC823,MGC803 and SGC7901 were treated with IFN-γ (10 μg/L)for 12 h. The relative expression of PD-L1 mRNA was analysed by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4IFN-γ刺激不同胃癌細(xì)胞株前后PD-L1mRNA相對表達(dá)量

在胃癌進(jìn)展過程中，IFN-γ逐漸減少，甚至難以檢測[10],因此我們推測IFN-γ下降與胃癌分期有關(guān)。焦付豐等[11]亦發(fā)現(xiàn)胃癌患者IFN-γ較正常對照組分泌減少；劉曉玲等[12]研究證實(shí)胃癌化療后部分緩解的患者IFN-γ較化療前升高。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明IFN-γ能抑制腫瘤生長及腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，并在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，故IFN-γ被廣泛用于臨床抗腫瘤治療。本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)持續(xù)IFN-γ刺激可上調(diào)胃癌細(xì)胞株P(guān)D-L1蛋白的表達(dá)；且不同胃癌細(xì)胞對上調(diào)PD-L1蛋白所需IFN-γ刺激濃度、時間不一，考慮可能與細(xì)胞對IFN-γ敏感程度差異有關(guān)[13]；為了進(jìn)一步探討IFN-γ在mRNA水平對PD-L1誘導(dǎo)情況，我們選用文獻(xiàn)中常用的IFN-γ濃度(10 μg/L)刺激胃癌細(xì)胞，利用real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)IFN-γ刺激胃癌細(xì)胞后，PD-L1 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前導(dǎo)致IFN-γ上調(diào)PD-L1表達(dá)的機(jī)制尚不明確，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在PD-L1啟動子區(qū)域含有數(shù)個IFN-γ反應(yīng)元件[6，14]，我們從mRNA及蛋白水平均發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ處理后胃癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高，故推測IFN-γ可能在PD-L1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平發(fā)揮作用，從而上調(diào)其在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)。但PD-L1具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)證明IFN-γ可上調(diào)胃癌細(xì)胞PD-L1表達(dá), 而腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，能降低其自身免疫原性，促使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)攻擊[14]，表明IFN-γ并非都是抑制腫瘤增殖、生長，可能一定程度上促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[5]，所以臨床上運(yùn)用IFN-γ治療腫瘤時應(yīng)謹(jǐn)慎。

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Interferon-γup-regulatesprogrammeddeathligand1inhumangastriccancercells

CHEN Shu-fen1, HOU Jing-ying2, WU Shu-yun1, WANG Ling-yun1

(1DepartmentofGastroenterology,2EmergencyDepartment,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xzr020@aliyun.com)

AIM: To study the expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) in human gastric cancer cells with or without the stimulation of interferon-γ (IFN-γ).METHODSThe protein levels of PD-L1 in 4 different human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901 with or without IFN-γ treatment were analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of PD-L1 in those cell lines was also detected by real-time PCR.RESULTSFlow cytometry analysis showed that the rates of PD-L1 surface expression in the 4 human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901 were (1.567±0.109)%, (2.640±0.577)%, (1.760±0.236)% and (16.030±1.289)%, respectively. After the 4 gastric cancer cell lines were treated with IFN-γ at different concentrations or for different time, the PD-L1 surface expression increased at different levels with significant differences between groups. Real-time PCR also indicated that IFN-γ up-regulated PD-L1 expression at mRNA level.CONCLUSIONPD-L1 surface expression is found in human gastric cancer cell lines AGS, BGC823, MGC803 and SGC7901. IFN-γ up-regulates the expression of PD-L1. SGC7901 cell line, which is from metastatic lymph nodes, expresses the highest protein level of PD-L1 among the 4 cell lines, indicating that PD-L1 expression may be related to lymph node metastasis, not to differentiation grade. IFN-γ may mediate the tumor immune escape so that it should be carefully applied in the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer cells; Programmed death ligand 1; Interferon-γ; Prognosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.006

1000- 4718(2013)11- 1952- 05

2013- 08- 20

2013- 10- 02

廣東省科技社會發(fā)展項(xiàng)目(No. 2012B031800362)

△通訊作者 Tel：020-81332489；E-mail:xzr020@aliyun.com