張繼文，王麗梅，馬琳，肖潔

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

核桃又名胡桃，原產(chǎn)于歐洲東南部、西亞等地區(qū)，我國大部分地區(qū)都有分布［1］。據(jù)《本草綱目》記述，核桃仁有“補氣養(yǎng)血，潤燥化痰，益命門，處三焦，溫肺潤腸，治虛寒喘咳，腰腳重疼，心腹疝痛，血痢腸風(fēng)”等功效，被譽為“萬歲子”、“長壽果”，在中醫(yī)用廣泛［2－4］。核桃蛋白是一種很好的植物蛋白，在脫脂的核桃粕中，蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%［5］。每100 g核桃可提供6.31 kcal的能量［6］。核桃蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸，其中包括多種人體必需氨基酸，尤其是精氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸等含量非常高，8種必需氨基酸的含量比例合理，具有很高的使用價值和保健功能［7－8］。

本實驗以浙江臨安山核桃為原料，通過對提取溫度、堿水提取pH值、等電點三個因素進(jìn)行研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)曲面優(yōu)化核桃蛋白提取的工藝參數(shù)，提高提取率，以期找到核桃蛋白提取最佳的的生產(chǎn)工藝，促進(jìn)我國的核桃蛋白深加工的發(fā)展。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

臨安山核桃:產(chǎn)自浙江省臨安市，市場購買后常溫密封袋保存;石油醚 分析純;甲醇 分析純;正己烷分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TD型電子天平，余姚市金諾天平儀器有限公司產(chǎn)品;Cslol-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，重慶銀河實驗儀器有限公司提供;Ac220V型多振幅恒溫軌道搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZD型循環(huán)水真空泵，水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司;H1650型高速臺式離心機，長沙湘儀離心機設(shè)備有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃原料的預(yù)處理

將去殼后的核桃仁放入50℃的熱水中，浸泡8 min，去皮，核桃仁置于55℃的烘箱中烘干，研碎成粉末［10］。采用石油醚浸泡核桃粉末并放入多振幅恒溫軌道搖床振蕩兩小時，取出后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中抽濾，然后烘干得到核桃粉末樣品。

1.3.2 單因素實驗

(1)提取溫度對核桃蛋白提取率的影響 核桃蛋白的變性溫度為67.05℃，所以溫度設(shè)定在60℃以下［10］。

取樣品2 g，加100 mL蒸餾水混勻，分別將樣品加熱至30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃后，再調(diào)pH 至9.0，并保持30 min，靜置冷卻10 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液調(diào)至pH4.5，3 000 r/min 離心 10 min，取沉淀，干燥稱重。

(2)堿提pH對核桃蛋白提取率的影響 取樣品2 g，加100 mL蒸餾水混勻，將樣品加熱到50℃后，分別將樣品用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，保持 30 min，靜置冷卻 10 min，3 000 r/min 離心 10 min，取上清液，調(diào) pH4.5，3 000 r/min離心10 min，取沉淀，干燥稱重。

(3)酸沉pH(等電點)對核桃蛋白提取率的影響 取樣品2 g，加100 mL蒸餾水混勻，將樣品加熱到50℃，用NaOH溶液調(diào)pH為9.0，保持30 min，靜置冷卻10 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分別用 HCL 溶液調(diào) pH 到 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，3 000 r/min離心10 min，取沉淀，干燥稱重。

1.3.3 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化核桃蛋白提取工藝

綜合單因素實驗結(jié)果，確定核桃蛋白的提取溫度，堿提pH值以及等電點pH，運用Design Expert 7.0軟件(Stat-Ease，Inc.)，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析法，以核桃蛋白的提取率為響應(yīng)值做響應(yīng)曲面，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 Box-Benhnken實驗因素與水平的選取

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定

采用凱氏定氮法，參見GB/T5009.5-2003。

1.3.5 提取率計算

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對提取率的影響

從圖1可知，隨著溫度的增加，核桃蛋白質(zhì)的提取率逐漸增加，超過50℃之后，提取率開始呈下降趨勢。溫度為50℃時，核桃蛋白的提取率最高;40℃和60℃時的提取率次之。響應(yīng)面分析中選取45℃，50℃，55℃為溫度的3個水平。

圖1 溫度對提取率的影響

2.2 堿提pH值對提取率的影響

從圖2可知，pH值為9.0時，核桃蛋白的提取率最高，達(dá)到43%;pH 值為8.0和10.0時的提取率次之。在實驗中發(fā)現(xiàn)，pH值的變化會影響所提取核桃蛋白成品的顏色，而且隨著pH值的增大，顏色也來越深。但在pH 值8.0－11.0范圍內(nèi)，顏色較淺。響應(yīng)面分析中選取 8.5，9.0，9.5 為堿水提取pH值的3個水平。

圖2 堿提pH對提取率的影響

2.3 等電點對提取率的影響

由圖5可知，在 pH 值為4.5—5.0時，核桃蛋白的提取率的波動范圍不大，其中，pH值為4.5時，核桃蛋白的提取率最高。由此可以判斷，核桃蛋白等電點為4.5。響應(yīng)面分析中，酸沉pH值均選擇4.5。

圖3 酸沉pH值(等電點)對提取率的影響

2.4 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化核桃蛋白的提取工藝

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素影響的實驗結(jié)果，以堿溶pH(X1)、等電點(X2)、提取溫度(X3)，核桃蛋白的提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面分析試驗。響應(yīng)曲面分析方案及實驗結(jié)果見表2。采用Design Expert 7.0軟件對響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程及方差分析

經(jīng)過F檢驗，Prob＞F值小于0.01，說明三個因素對提取率的影響都是高度顯著的，而 R2=0.987 9，說明所得的回歸方程非常顯著，所以回歸方程能夠很好的模擬真實的曲面。

為了更直觀的反應(yīng)三個因素間的相互作用對提取率的影響，做出兩兩自變量為坐標(biāo)的3D圖。圖4為堿溶pH(X1)與等電點(X2)的交互作用對于提取率(Y)的影響，核桃蛋白提取率曲線呈現(xiàn)出先上升到平緩穩(wěn)定再到略有下降的狀態(tài)。隨著pH(X1)的升高，以及等電點(X2)的延長，提取率上升。當(dāng)pH、等電點分別增大到一定程度時，提取率(Y)趨于飽和，響應(yīng)曲面變平緩，隨后若再同時增大pH、等電點時，提取率會略有下降。因此，最佳取值點應(yīng)取在最有效提取出大部分核桃蛋白，即提取率不再顯著增高的坐標(biāo)點處。

圖4 等電點與堿溶pH的交互作用對提取率的影響

圖5是溫度與pH交互作用提取率影響的響應(yīng)曲面等高圖，圖6是溫度和等電點交互作用對提取率影響的響應(yīng)曲面等高圖，反映出的結(jié)果與圖4類似，通過計算本實驗的回歸方程，可得到三個因素的最佳作用值。

圖5 溫度與pH交互作用對提取率的影響

圖6 溫度和等電點交互作用對提取率的影響

2.5 最佳工藝的推導(dǎo)及驗證

利用上述的分析進(jìn)行最優(yōu)工藝的推導(dǎo)，對得到的回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)為零得到:

聯(lián)立方程(2)、(3)、(4)求解，得到 X1=0.135，X2=0.248，X3=0.0906，換算得到最佳工藝條件為pH=9.07，等電點 =4.62，溫度 =50.45 ℃ 的條件下經(jīng)過回歸方程計算提取率為Y=44.54%。

取上述得到的工藝條件為實驗條件，進(jìn)行驗證試驗結(jié)果如表3所示。

從表中可以看出，實驗值與理論值比較接近，其誤差為0.8%。按照此條件進(jìn)行三次提取，平均值為44.50%。因此，可知利用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化后的工藝提高了核桃蛋白的提取率，工藝參數(shù)真實可靠、具有實用價值。

表3 實驗結(jié)果的驗證(n=3)

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過三因素三水平的響應(yīng)曲面分析法對堿溶酸沉浸提法進(jìn)行工藝優(yōu)化，結(jié)果表明，提取核桃蛋白的最佳工藝條件為堿水pH值9.07 ，等電點 4.62，溫度 50.45 ℃，在此條件下提取率為44.50%。本實驗利用響應(yīng)曲面分析法來優(yōu)化提取核桃蛋白質(zhì)的影響因素，從而為提高核桃蛋白的提取率提供了理論依據(jù)。

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