云 環(huán)， 劉 鑫， 王 靜， 嚴 華， 崔鳳云， 張朝暉

（北京出入境檢驗檢疫局技術中心，北京 100026）

分子結構中含有偶氮基（-N＝N-）的染料統(tǒng)稱為偶氮染料，其偶氮基常與一個或多個芳香環(huán)系統(tǒng)相連構成一個共軛體系而作為染料的發(fā)色體，幾乎分布于所有的顏色，廣泛用于紡織品、皮革制品等染色及印花工藝。研究表明，用致癌芳香胺合成的偶氮染料受到人體腸道細菌以及偶氮還原酶的作用而易于發(fā)生偶氮還原裂解，重新釋放出致癌芳香胺，從而產(chǎn)生致癌作用［1］。德國、歐盟、日本及我國都明文規(guī)定：對于檢測出禁用偶氮染料的紡織品一律禁止生產(chǎn)和銷售。

傳統(tǒng)的芳香胺檢測方法，如氧化顯色法［2］、重氮偶合法［3］、紙色譜法［4］、薄層色譜法［5］、特定顯色劑法［6］等，實驗操作復雜，對分析人員的技術要求比較高，且常常受到樣品量太小的限制而難以奏效。常見的儀器分析法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-11］、液相色譜法［12］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13，14］。靜電場軌道阱（orbitrap）高分辨質(zhì)譜具有質(zhì)量分辨率高和能提供精確相對分子質(zhì)量的功能，在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以根據(jù)檢測需求反復調(diào)用，由此彌補傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜方法無法應對法規(guī)更新頻繁的不足；其數(shù)據(jù)依賴性掃描（data-dependent scan）可以在篩查的同時，通過碎片離子進行定性確證；近年來其在食品檢測、蛋白質(zhì)組學［15，16］等方面已開始逐漸應用，但在紡織品檢測領域尚屬空白。

本文建立了高效液相色譜-線性離子阱／靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-LTQ／Orbitrap MS）快速篩查確證紡織品中禁用偶氮染料的方法。采用全掃描和正離子切換模式進行測定，通過提取一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進行定性和定量，自動觸發(fā)二級全掃描質(zhì)譜進一步提高定性的準確性。該方法和現(xiàn)有文獻報道方法相比更為快速、準確，實際樣品測定驗證了其高靈敏度和可靠性，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HPLC-LTQ-Orbitrap XL高效液相色譜-線性離子阱／靜電場軌道阱組合質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）；微孔濾膜（0.20μm，美國Pall公司）；超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；小型高速離心機（德國Sigma公司）；Chromabond XTR偶氮萃取柱（14.5g／70mL，德國 Macherey-Nagel公司）。

21種致癌芳香胺標準品（純度大于98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、叔丁基甲醚（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國Tedia公司）；檸檬酸、氫氧化鈉、連二亞硫酸鈉（分析純，北京化學試劑公司）；實驗用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。0.06mol／L檸檬酸鹽緩沖溶液（pH 6）：取12.526g檸檬酸和6.320g氫氧化鈉溶于水，定容至1000mL即得。21種致癌芳香胺的標準儲備液用甲醇配制，系列標準工作溶液用甲醇-水（2∶8，v／v）配制。

1.2 樣品前處理

將樣品剪成5mm×5mm小片，稱取1.0g，加入17mL預熱到（70±2）℃的檸檬酸鹽緩沖溶液，振搖，置于（70±2）℃水浴中30min；加入3.0mL 200g／L連二亞硫酸鈉溶液，置于（70±2）℃水浴中30min，冷卻至室溫。提取液倒入硅藻土提取柱內(nèi)，吸附15min。用80mL叔丁基甲醚分4次反復洗提反應器中的試樣，合并入提取柱中。收集叔丁基甲醚提取液，于35℃低真空下濃縮至1mL，再用氮氣濃縮至近干。1mL甲醇溶解并定容，過0.2μm微孔濾膜，濾液待測。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50mm×2.1mm，1.7μm；美國 Waters公司）。流動相 A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～5.0min，90%A～5%A；5.0～7.0min，5%A；7.0～7.1min，5%A～90%A；7.1～8.0min，90%A。流速：0.25mL／min；柱溫：35℃；進樣體積：5.0μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；毛細管溫度350℃，鞘氣（N2）流速為17L／min（即30arb），輔助氣（N2）流速8 L／min（即10arb）；在正離子模式下用Orbitrap檢測器全掃描（full scan）和data-dependent scan模式檢測；全掃描的分辨率R＝60000；data-dependent scan模式：當Event 1中的檢測信號超過Parent List中化合物的設定閾值時，自動觸發(fā)Event 2；二級質(zhì)譜采用碰撞誘導解離（CID）方式產(chǎn)生碎片離子，碰撞裂解氣為高純氦氣，碰撞能量為35%。

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜電離條件的選擇

CID電壓是串聯(lián)質(zhì)譜中影響碎片離子強度的重要參數(shù)，對檢測靈敏度和特征離子碎片信息的豐度有直接影響。當CID電壓較低時，目標碎片離子峰強度較弱，靈敏度相對較差；當CID電壓超過一定強度，會產(chǎn)生過多的碎片離子而影響目標碎片離子的甄別。質(zhì)譜條件優(yōu)化結果為：CID電壓在35%時，21種芳香胺分別得到各自特征的碎片，且分子離子峰和特征碎片離子峰的豐度比例相對穩(wěn)定，可以達到對待測物質(zhì)的定性及定量要求。歐盟EC 2002／657［17］規(guī)定：使用高分辨質(zhì)譜時，母離子識別點是2.0，子離子識別點是2.5，禁用物質(zhì)的識別點是4.0。據(jù)此，本實驗通過一級母離子篩查和二級CID碎片離子確證對檢測結果進行判定。21種致癌芳香胺的MS分析參數(shù)見表1。

表1 21種致癌芳香胺的HPLC-LTQ／Orbitrap MS分析參數(shù)Table 1 HPLC-LTQ／Orbitrap MS analysis parameters of the 21 carcinogenic aromatic amines

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

目前國內(nèi)外測定偶氮染料的還原產(chǎn)物芳香胺時采用的流動相均為甲醇-磷酸緩沖鹽體系，但是使用緩沖鹽體系時負載較大，會極大地影響色譜柱的使用壽命，而且磷酸鹽為非揮發(fā)性酸，易污染離子源，與質(zhì)譜儀不能兼容。將流動相由甲醇-磷酸緩沖鹽體系改為甲醇-水體系后，試驗結果顯示各物質(zhì)的峰形不好。在實際的反相液相色譜工作中，一般直接用酸或堿調(diào)節(jié)pH值來抑制弱解離化合物的離解。本實驗在流動相的水相中加入甲酸，采用梯度洗脫方式，21種致癌芳香胺可以得到有效的分離。21種致癌芳香胺標準物質(zhì)的總離子流（TIC）色譜圖和CID質(zhì)譜圖見附圖（http：／www.chrom-China.com／UserFiles／File／sp1301031-Fig.doc）。

2.3 樣品的提取和凈化

2.3.1 還原時間

禁用偶氮染料檢測的原理為：染料在檸檬酸鹽緩沖溶液介質(zhì)中用連二亞硫酸鈉還原分解，檢測其分解產(chǎn)物中的致癌芳香胺。偶氮染料是否還原充分直接影響檢測結果：還原時間不夠會降低偶氮染料的被還原程度，致使檢測結果偏低；還原時間較長又會增加檢測成本，延長檢測時間，降低檢測效率。本實驗就還原時間對檢測結果的影響進行了考察，結果顯示：對于棉質(zhì)樣品，還原時間為10min時偶氮染料還未完全還原；還原時間延長至15min時還原充分；繼續(xù)延長還原時間，發(fā)現(xiàn)還原效果無明顯改善。這是由于棉質(zhì)樣品易被充分浸透，有利于還原反應的發(fā)生。但是對于滌綸等材質(zhì)樣品時，還原時間為20min才能充分還原。由于紡織品材質(zhì)種類復雜，染料種類也較多，建議還原時間定為30min以保證充分還原。

2.3.2 萃取試劑的選擇

偶氮染料檢測的常用萃取試劑為乙醚，但乙醚儲存過程中易產(chǎn)生過氧化物，使用之前需通過硫酸亞鐵溶液處理及蒸餾將其中的氧化物去除。該去除過程較為危險，易引起爆炸。而叔丁基甲醚儲存穩(wěn)定，不易生成過氧化物。本研究對未經(jīng)過處理的乙醚、處理過的乙醚、叔丁基甲醚的萃取效果進行了對比，結果顯示：未經(jīng)處理的乙醚的萃取效率約為處理過的乙醚的1／2；處理過的乙醚和叔丁基甲醚效果相差無幾，但叔丁基甲醚作萃取劑的結果比乙醚作萃取劑的結果更為穩(wěn)定。綜合安全因素，本研究選用叔丁基甲醚作為萃取劑。

2.4 線性范圍、定量限、回收率和精密度

分別配制 0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg／L的系列混合標準溶液進行測定，以各致癌芳香胺的峰面積對其質(zhì)量濃度進行線性回歸，在0.05～2.00mg／L范圍內(nèi)線性關系良好（r≥0.99）。在空白樣品中進行加標試驗，前處理后按加標濃度由高至低檢測，以信噪比等于10（S／N＝10）對應的濃度確定為定量限（LOQ）。本實驗中，在0.08 mg／kg添加水平上，所有21種致癌芳香胺的儀器信噪比均大于10，確定該方法的LOQ可達到0.08 mg／kg。在棉、滌綸兩種樣品中添加21種致癌芳香胺的標準溶液，添加水平分別為0.5、1.0和2.0 mg／kg，每個添加水平平行測定6次，回收率范圍在65.5%～111.5%之間，相對標準偏差（RSD）為0.87%～2.49%（見表2）。

表2 空白樣品中3個加標水平的21種致癌芳香胺的回收率范圍及相對標準偏差Table 2 Recovery ranges and RSDs of the 21 carcinogenic aromatic amines at three spiked levels

2.5 方法的應用

將建立的方法應用于50份實際紡織品樣品的檢測，從中檢出2份樣品含有對氯苯胺，1份含有聯(lián)苯胺和3，3′-二氯聯(lián)苯胺，1份含有2-萘胺，其余樣品未檢出。

3 結論

本文建立的紡織品中禁用偶氮染料的快速、高通量的高效液相色譜-線性離子阱／靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測方法，在8min內(nèi)完成了對21種致癌芳香胺的篩查和確證，獲得了滿意的分離效果和檢測靈敏度。方法的定量限滿足國內(nèi)外相關禁用偶氮染料的檢測要求，可作為一種快速篩查和確證檢測技術廣泛使用。

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