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        梨采后病害拮抗菌的分離與篩選

        2013-10-22 07:24:58張曉宇張則君韓巨才
        山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年7期
        關(guān)鍵詞:鏈格孢菌霉菌

        張曉宇,張則君,韓巨才

        (1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所,山西太原030031;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷030801)

        梨采后貯藏期和貨架期易被病害侵染,果肉易軟化腐爛,對貯藏保鮮造成很大困難,給果農(nóng)造成極大的經(jīng)濟損失。隨著社會的發(fā)展,人們對果蔬質(zhì)量的要求不斷提高,環(huán)保意識不斷加強,迫切需要新的安全有效的方法來控制果蔬的采后病害。由于生物抑菌劑防病效果明顯、無毒,且成本低,成為果蔬保鮮的重要發(fā)展方向,也是減少化學(xué)藥劑使用量的有效途徑[1]。

        對梨采后病害的拮抗菌研究始于20世紀(jì)80年代,Chand 等[2]和 Sugar等[3]分別發(fā)現(xiàn)了 Cryptococcus albidus和Cryptococcus infirmominiatus,用于抑制青霉菌(Penicillium expansum);Janisiewicz等[4]和 Lima等[5]分別發(fā)現(xiàn)了Pseudomonas syringae和Rhodotorula glutinis,用于抑制灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea);謝莉[6]和齊冬梅等[7]分別發(fā)現(xiàn)了Streptomyces aureus和Bacillus subtilis,用于抑制鏈格孢菌(Alternaria alternata)。用于生物防治的拮抗菌涵蓋了細菌、酵母菌和放線菌,充分說明生防菌具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

        本試驗從各種水果和葉片表面進行拮抗菌的分離,篩選出對梨采后致病菌有拮抗作用的細菌,旨在為探索新的梨采后病害防治途徑提供一定理論指導(dǎo)。

        1 材料和方法

        1.1 供試材料

        1.1.1 梨、杏、西梅、黑李、冬棗、葡萄、山楂、桃無病蟲害及機械損傷的果實和葉片 梨采自山西省清徐縣高花鄉(xiāng)高花村,杏采自山西省大同市陽高縣,西梅、黑李、桃均采自山西省太原市金灘村,山楂分別采自山西省太原市金灘村和山西省太谷縣,冬棗采自山東省沾化縣,葡萄采自山西省清徐縣。試材于2011年8—9月采回,當(dāng)天運回實驗室,裝袋后存放于冰箱。

        1.1.2 供試病原菌 梨鏈格孢菌(Alternaria alternata)、梨鐮刀菌(Fusarlum poae)、梨毛霉菌(Mucoraceae racemosus)均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所采后病理研究室分離保存。將病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7~14 d,用無菌水制成孢子懸浮液,血球計數(shù)板計配濃度為1×104個孢子/mL。

        1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基:牛肉膏為 5 g,蛋白胨為10 g,NaCl為 5 g,瓊脂粉為10 g,水1 000 mL,pH值7.2;酵母膏蛋白胨(LA)培養(yǎng)基:酵母膏 5 g,蛋白胨 10 g,NaCl 5 g,瓊脂粉 10 g,水1 000 mL,pH 值 7.4;馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂 10 g,水 1 000 mL,pH值為6.5~7.0。

        1.2 拮抗菌的分離

        分別取梨、梨葉、杏、杏葉、西梅、黑李、冬棗、葡萄、葡萄葉、山楂、山楂葉、桃、桃葉放入燒杯中,使用0.05 mL/L的磷酸緩沖液(pH值為6.5)沖洗2次,第1次在搖床100 r/min旋轉(zhuǎn)振蕩器中洗滌10 min,保留洗液;第2次用超聲沖洗10 min,保留洗液。

        取無病無傷、大小和成熟度相似的梨果,用2%的次氯酸鈉溶液表面消毒后,自然晾干。在梨果上用接種針挖3 mm×3 mm的孔,每個孔注入2次的洗液各20 μL,待晾干后再注入病原菌孢子懸浮液20 μL(1×104個孢子 /mL)。晾干后將梨果裝入塑料筐內(nèi),套保鮮袋,扎口,保持濕度在95%左右,室溫下7 d后檢查。選取未發(fā)病,且傷口處長有拮抗菌菌落形態(tài)的梨果,用無菌接種針刮取菌落表層,在研缽中研碎。用0.05 mL/L的磷酸緩沖液(pH值為6.5)定容4 mL,分別稀釋10倍和100倍。分別取此稀釋后的懸浮液各100 mL,用涂布器分別涂在NA,LA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)48 h后,把具有不同形態(tài)特征的單一菌落分別在NA,LA培養(yǎng)基平皿上劃線,挑取純化后的單菌落,用小試管斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 拮抗菌的篩選

        采用平板對峙培養(yǎng)法[8],處理用直徑1 cm的打孔器取病原菌菌塊放于PDA平板中央,在距其2.5 cm的地方用無菌接種針各沾一環(huán)單菌落劃一條線,同時以不劃線直接病原菌菌塊為對照,每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)4~6 d后,觀察不同菌株是否對病原菌有抑制生長的作用及測量抑菌圈的大小。按照抑菌半徑的大小,將拮抗菌的拮抗作用分為強、中、弱3類。

        2 結(jié)果與分析

        結(jié)果表明,從梨果表面共獲得細菌分離物89株,再經(jīng)過篩選試驗得到以下結(jié)果。

        2.1 拮抗細菌對植物病原真菌的抑制作用

        以梨鏈格孢菌(Alternaria alternata)、梨鐮刀菌(Fusarlum poae)、梨毛霉菌(Mucoraceae racemosus)為靶標(biāo)菌,用平板對峙培養(yǎng)法測試了89株菌對病原真菌的拮抗作用,結(jié)果表明,有5株細菌菌株對3種病原真菌均具有較強的拮抗作用,占篩選到菌株總數(shù)的5.6%。

        從表1可以看出,拮抗細菌菌株可以分為3類:HM3和XM2除菌落大小不同外,具有相似的菌落形態(tài)特征;XY1區(qū)別于其他菌株的最大特點是其呈黃綠色透明狀;HJL6和L4具有相似的菌落形態(tài)特征。

        表1 拮抗細菌菌落的形態(tài)特征

        2.2 細菌對梨鏈格孢菌的抑制作用

        通過對89株細菌菌株進行生長對峙試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有10株菌對梨鏈格孢菌的生長有抑制作用,占到菌株總數(shù)的11.2%;對梨鏈格孢菌有較強抑菌作用的菌株是 HM3,HM2,XM2,XY1,TYSZ6,PT4;對梨鏈格孢菌抑菌作用較弱的菌株是HJL6,HJL4,L4,DZ2;其余菌株對梨鏈格孢菌無拮抗作用。其中,HM3和HM2的抑菌效果最為明顯,其抑菌率達到95%以上(表2)。

        表2 細菌對梨鏈格孢菌的抑制效果

        2.3 細菌對梨鐮刀菌的抑制作用

        通過對89株細菌菌株進行生長對峙試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有15個菌對梨鐮刀菌的生長有抑制作用,占菌株總數(shù)的16.9%,其中,有較強抑菌作用的菌株 是 HJL6,L4,HM3,HM2,XY1,DZ2,TYSZ6,PT4,SL2,抑菌作用較弱的菌株是 XM2,HJL4,HJL5,XM1,HM4,DZ1,其余菌株無拮抗作用。其中,HJL6,HM2和XY1的抑菌效果最為明顯,其抑菌率達到95%以上(表3)。

        表3 細菌對梨鐮刀菌的抑制效果

        2.4 細菌對梨毛霉菌的抑制作用

        通過對89株細菌菌株進行生長對峙試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有11個菌株對梨毛霉菌的生長有抑制作用,占菌株總數(shù)的12.4%,有較強抑菌作用的菌株是 HJL4,XM2,HM3,L4,XY1,TYSZ6,抑菌作用較弱的菌株是 XM1,SZY3,TYSZ7,TGSZ2,TY3,其余菌株無拮抗作用。其中,HJL4和XM2的抑菌效果最為明顯,其抑菌率達到95%以上(表4)。

        表4 細菌對梨毛霉菌的抑制效果

        3 結(jié)論與討論

        根據(jù)本試驗篩選的有拮抗作用的細菌形態(tài)特征初步推知,拮抗細菌的菌落形態(tài)各異,拮抗能力與菌落形態(tài)并不存在必然聯(lián)系。另外,大量的研究表明[9-13],離體(in vitro)條件下和活體(in vivo)條件下的拮抗能力不一定一致,不存在相關(guān)性,不能根據(jù)一個方面的抗病能力就淘汰或肯定一株細菌。

        本試驗得到的HM3和XY1這2株細菌對梨鏈格孢菌(Alternaria alternata)、梨鐮刀菌(Fusarlum poae)、梨毛霉菌(Mucoraceae racemosus)3 種致病菌均有顯著抑菌效果,還有待于對其進行生理生化和分子生物學(xué)鑒定,并對其進行抑菌譜的測定,以便為梨采后病害生物防治提供理論依據(jù)。

        [1]范青,田世平,徐勇,等.季也蒙假絲酵母對采后桃果實軟腐病的抑制效果[J].植物學(xué)報,2000,42(10):1033-1038.

        [2]Chand-Goyal T,Spotts R A.Control of postharvest pear diseases using natural saprophytic yeast colonists and their combination with a low dosage of thiabendazole[J].Postharvest Biol Technol,1996,7:51-64.

        [3]Sugar D,Spotts R A.Control of postharvest decay in pear by four laboratory-grown yeasts and tworegistered biocontrol products[J].Plant Dis,1999,83:155-158.

        [4]Janisiewicz W J,Marchi A.Control of storage rots on various pear cultivars with a saprophytic strain of Pseudomonas syringe[J].Plant Dis,1992,76:555-560.

        [5]Lima G,De-Curtis F,Castoria R,et al.Activity of the yeast Cryptoccus laurentii and Rhodotorula glutinis against postharvest rots on different fruits[J].Biocontrol Science and Technology,1998,8:257-267.

        [6]謝莉.梨黑斑病拮抗放線菌的選育及其抗菌物質(zhì)研究[D].石家莊:河北師范大學(xué),2008.

        [7]齊東梅,惠明,梁啟美,等.枯草芽孢桿菌H110對蘋果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2005,11(2):171-174.

        [8]李麗霞,夏明聰,孔景萍.拮抗菌對土傳病害防治效果的初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(3):54-55.

        [9]范青.果實采后病害生物防治及其機理研究[D].北京:中國科學(xué)院植物研究所,2001.

        [10]Anisiewicz W J,Tworkoski T J,Sharer C.Characterizing the mechanism of biological control of postharvest diseases on fruits with a simple method to study competition for nutrients[J].Phytopathology,2000,90(11):1196-1200.

        [11]高芬,馬利平,喬雄梧.對番茄早疫病拮抗菌的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2001,29(3):64-66.

        [12]程根武,王勇,楊秀榮,等.拮抗酵母菌用于產(chǎn)后病害生物防治的研究進展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,8(1):44-46.

        [13]馬利平,喬雄梧,高芬,等.B96-11對3種枯萎病的防治效果及拮抗物質(zhì)初步分析[J].華北農(nóng)學(xué)報,2006,21(4):99-102.

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