胡格華 蘇香萍 潘 虹 李 洋 龔大春，2 鄒 坤

（1.三峽大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所，湖北 宜昌 443002）

我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈又是世界上最豐富的纖維素類物質(zhì)之一.然而目前這一巨大資源不僅沒有得到充分利用，反而大部分焚燒或被棄置于環(huán)境中造成環(huán)境污染和資源的浪費(fèi).如何利用纖維素酶將這些秸稈纖維素廢棄物大規(guī)模地轉(zhuǎn)化為簡單糖類或蛋白質(zhì)等產(chǎn)品，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酒精、飼料等已成為全世界研究的熱點(diǎn)，也是緩解當(dāng)今世界所面臨的糧食短缺、飼料資源的緊張、能源危機(jī)和環(huán)境污染等問題的有效途徑之一［1－3］.

自然界中能分解纖維素的生物主要為真菌類和部分細(xì)菌，以木霉、曲霉、青霉的能力最突出，但目前研究最多的是一些真菌經(jīng)物理、化學(xué)處理（輻射、蒸汽爆破、酸化、堿化等）后的纖維素酶的作用，生產(chǎn)成本高，對環(huán)境的污染嚴(yán)重，限制了農(nóng)作物秸稈的高效利用.因此篩選性能穩(wěn)定的纖維素酶菌株，研究其對未處理的天然纖維素的降解作用來解決上述問題至關(guān)重要［4］.

目前所選育出來的一些菌種雖具有一定的產(chǎn)酶能力，但是應(yīng)用于生產(chǎn)還不是很理想，有待于進(jìn)一步選育出更多高活力優(yōu)良菌株.本課題選用CMC－Na培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化單個菌株，經(jīng)剛果紅染色初篩，挑選透明圈直徑與菌落直徑比大的菌株進(jìn)行三角瓶固體培養(yǎng)復(fù)篩，通過測定其酶活復(fù)篩出一株產(chǎn)纖維素菌株酶活較高的菌株，通過單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化其最佳的產(chǎn)酶發(fā)酵條件.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1）選擇培養(yǎng)基［5－6］，即羧甲基纖維素鈉 （CMCNa）培養(yǎng)基:氯化鈉6g，硫酸鎂0.1g，磷酸二氫鉀0.5 g，二氯化鈣0.1g，磷酸氫二鉀2.0g，CMC－Na 15g，硫酸銨2g，瓊脂1.5%，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.4.

2）菌種保藏培養(yǎng)基:PDA瓊脂培養(yǎng)基.

3）液體種子培養(yǎng)基:硫酸銨1%，硫酸鎂0.1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖6%，蒸餾水100mL.

4）三角瓶固體培養(yǎng)基:稻草6g，麩皮6g，于250 mL三角瓶中，加入營養(yǎng)液36mL，混勻后滅菌.營養(yǎng)液:磷酸二氫鉀1%，硫酸銨1%～2%，硫酸鎂0.1%.

以上培養(yǎng)基均需在121℃、0.5MPa下滅菌20min.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SW－CJ－1Cu雙人單面凈化工作臺:武漢市志飛凈化設(shè)備技術(shù)有限公司；HQD98L恒溫培養(yǎng)搖床:武漢海聲達(dá)儀器設(shè)備有限公司；BPC－250F生化培養(yǎng)箱:武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；UV－1100紫外可見分光光度計(jì):上海天美科學(xué)儀器有限公司；THZ－98AB恒溫振蕩水槽:北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離纖維素酶產(chǎn)生菌的樣品采集

從三峽地區(qū)丘陵地帶不同生態(tài)環(huán)境采集爛草、朽木、肥沃的菜地土壤、發(fā)霉的桔子皮和蘋果核作為分離篩選纖維素酶產(chǎn)生菌的樣品.

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩［5－6］

將采集到的腐爛的各含菌的樣品放在三角瓶中，加入一定量的蒸餾水，充分?jǐn)噭蚝箪o置，用三層紗布過濾，再靜置，吸取上清液分別稀釋1，2，3，4，5，6倍，將稀釋液涂布在CMC－Na選擇培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2～3d，從培養(yǎng)基上挑取單菌落于CMC－Na平板上劃線分離純化，獲得的菌株分別轉(zhuǎn)接于CMCNa平板上，28℃再培養(yǎng)2d，用剛果紅染色10min后再用NaCl脫色5min，能分解纖維素酶的菌株周圍會出現(xiàn)清晰的透明圈，選擇出透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌株保藏為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備.

1.2.3 制備種子液

在無菌操作臺上將初篩得到的保藏菌種挑取一環(huán)于已滅菌的液體種子培養(yǎng)基中，每一菌種培養(yǎng)一瓶種子液，28℃振蕩培養(yǎng)2～3d.

1.2.4 三角瓶固體培養(yǎng)復(fù)篩

接種10mL種子于已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢韬笥?8±1℃恒溫箱中培養(yǎng)72h成曲，每24h時振蕩培養(yǎng)瓶一次.

1.2.5 菌種初步鑒定

通過菌落形態(tài)觀察、顯微鏡檢的特征，對菌株進(jìn)行初步鑒定.

1.2.6 酶活測定

羧甲基纖維素酶（CMCase）活性、濾紙酶（FPA）活性和β－葡萄糖苷酶活性（β－G酶活），采用3，5－二硝基水楊酸顯色法（DNS法）［7－8］測定.

1.2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

在250mL錐形瓶中進(jìn)行液體發(fā)酵，在研究pH對菌株產(chǎn)酶的影響時，種子液按5%的接種量接種到50mL、溫度28℃的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后分別置于初始pH 5、6、7、8、9下，120r／min搖床培養(yǎng)72h后，分別測定酶活，選出最佳培養(yǎng)pH.然后依次改變培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和裝液量中的某一因素，并保持其他發(fā)酵條件不變，通過測定CMCase、FPA活性和β－G酶活，研究各因素對產(chǎn)酶的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株分離、篩選

從三峽地區(qū)丘陵地帶采集的含菌爛草、朽木、肥沃的菜地土壤、發(fā)霉的桔子皮和蘋果核等作為分離樣品.采用剛果紅染色初篩到20株菌株，其中有3株菌的三種纖維素酶活性較高，如表1所示，菌株X3的三種纖維素酶活性最高.

表1 3株菌株的三種纖維素酶活力的比較

菌株X3的菌落形態(tài)描述如下:培養(yǎng)基上菌落顏色為黑色，菌落光滑，不透明；菌落開始時是白色，隨著時間的推移顏色加深，最后呈現(xiàn)黑褐色.其菌絲為蜘蛛網(wǎng)狀，分生孢子球形，孢子頭成放射狀.

根據(jù)《微生物分類學(xué)》［9］的描述:曲霉屬—營養(yǎng)菌絲體由具橫隔的分支菌絲組成，從菌絲特化形成厚而膨大的足細(xì)胞，在垂直長出直立的方向上長出分生孢子梗，分生孢子梗頂端膨大形成頂囊，某些種能產(chǎn)生菌核或類似菌核的結(jié)構(gòu)，還有少數(shù)產(chǎn)生殼細(xì)胞.

鑒定:各形態(tài)特征基本符合上述分類學(xué)描述，故屬絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬.

圖1和圖2分別為菌株X3在CMC－Na培養(yǎng)基生長的菌落特征，其菌落加剛果紅前和后的菌落形態(tài)比較.可見圖1加剛果紅前，培養(yǎng)基上菌落水解纖維素產(chǎn)生水解圈；圖2經(jīng)剛果紅染色及氯化鈉脫色后，所得菌落周圍可更清晰地看見透明圈.故選擇透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌株X3保藏并作為下一步產(chǎn)酶條件研究的對象，對其進(jìn)行單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

2.2 產(chǎn)酶條件的的研究

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響

在其他產(chǎn)酶條件不變的情況下，改變培養(yǎng)基初始pH，研究其對產(chǎn)酶的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，當(dāng)初始pH為6時，此三種酶活分別最高.可以看出過高和過低的pH都不利于該菌株X3的生長從而影響其酶的產(chǎn)量，其原因在于不適當(dāng)?shù)乃岷蛪A可以使酶的空間結(jié)構(gòu)在一定程度上遭到破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性減弱或喪失.故最適培養(yǎng)基的pH為6.

圖3 初始pH對酶活的影響

2.2.2 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

在其他產(chǎn)酶條件不變的情況下，研究培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響.結(jié)果如圖4所示，該圖也為菌株X3的生長曲線圖，可以看出該菌株在纖維素固體搖瓶培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好.當(dāng)培養(yǎng)時間為72h時，此時三種酶活分別最高.隨著培養(yǎng)時間的延長菌株X3生長逐漸成熟并趨進(jìn)于最佳產(chǎn)酶的生長階段，當(dāng)培養(yǎng)時間太長時，菌株老化，產(chǎn)酶能力下降，部分酶因環(huán)境等因素而活性有所下降，所以表現(xiàn)為有略微的下降.故最適培養(yǎng)時間為72h.

圖4 培養(yǎng)時間對酶活的影響

2.2.3 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

在其他條件不變的情況下，研究培養(yǎng)溫度對菌株X3產(chǎn)酶的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時，此時三種酶活分別最高.在一定培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，無論是菌株生長時體內(nèi)的生化反應(yīng)還是產(chǎn)酶反應(yīng)速率都有所加快，故酶活力有所升高；另一方面當(dāng)溫度過高，菌株體內(nèi)的蛋白質(zhì)有變性使得菌株的生長和產(chǎn)酶都有所影響.故最適培養(yǎng)溫度為28℃.

圖5 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

2.2.4 裝量對產(chǎn)酶的影響

在其他產(chǎn)酶條件不變的情況下，不同裝量對菌株X3產(chǎn)酶的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6，當(dāng)裝量為15mL／250mL三角瓶時，此時三種酶活分別最高.可以證明該菌株X屬于好氧菌株，在相同體積的三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，裝量（20mL）大則溶氧量相對較少，菌株沒有足夠的氧氣，酶活自然就較低，而在適宜的裝量（15 mL）條件下，產(chǎn)纖維素酶菌株生長旺盛，產(chǎn)酶能力最大，酶活最高，也符合工業(yè)生產(chǎn)中的低成本，高效率問題.故最適裝量為溫度為15mL／250mL三角瓶.

圖6 裝量對酶活的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)確定最佳生產(chǎn)發(fā)酵條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用溫度、時間、初始pH和裝量進(jìn)行四因素三水平正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分別測定FPA酶活、CMC酶活、β－G酶活，各酶活單位為IU／mL，最終以β－G酶活為考察指標(biāo)優(yōu)化產(chǎn)酶條件，正交設(shè)計(jì)見表2，正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見表3.

表2 因素水平表

綜合以上3個酶活的正交實(shí)驗(yàn)分析可得如下結(jié)論，裝量對酶活影響最大，其次分別為培養(yǎng)時間、初始pH值、培養(yǎng)溫度.菌株X3的最佳產(chǎn)酶條件為A2B2C2D2，在此最佳培養(yǎng)條件下的FPA酶活、CMC酶活、β－G 酶活分別:2.413IU／mL、2.406IU／mL、10.633IU／mL，分別是菌株X3初始酶活的1.04倍、2.20倍、1.19倍.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

1）本實(shí)驗(yàn)是從三峽地區(qū)丘陵地帶采樣經(jīng)稀釋富集培養(yǎng)、反復(fù)分離純化、剛果紅初染，從中挑選出透明圈直徑與菌落直徑比較大的三株纖維素酶產(chǎn)生菌，經(jīng)三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)得到一株酶活最高的產(chǎn)生菌X3，該菌株初步鑒定為曲霉屬，其CMC酶活為2.326 IU／mL、FPA酶活為1.093IU／mL、β－葡萄糖苷酶活為8.929IU／mL.

2）通過單因素實(shí)驗(yàn)對菌株X3產(chǎn)酶條件的初步探討，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)溫度為28℃，最佳培養(yǎng)時間為72h，最佳初始pH為6，最佳裝量為15mL／250mL三角瓶.

本文結(jié)果將為降低纖維素酶的生產(chǎn)成本和提高稻草秸稈粉的利用水平提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).本論文只對部分發(fā)酵條件進(jìn)行研究分析，進(jìn)一步工作可以對菌株X3進(jìn)行接種量、料水比、生長因子和翻動固體培養(yǎng)基的時間等發(fā)酵條件進(jìn)行研究，或?qū)ζ溥M(jìn)行誘變育種，從而綜合考慮以達(dá)到更高產(chǎn)酶水平.

［1］李 琦，劉伍生，劉正初.不同地點(diǎn)篩選纖維素酶產(chǎn)生菌的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（33）:194－198.

［2］Abdelnasser Salah Sheble Ibrahim，Ahmed I El－diwany.Isolation and Identification of New Cellulases Producing Thermophilic Bacteria from an Egyptian Hot Spring and Some Properties of the Crude Enzyme［J］.Australian Journal of Basic and Applied Sciences，2007，1 （4）:473－478.

［3］Goldemberg J.Ethanol for a Sustainable Energy Future［J］.Science，2007（315）:808－810.

［4］Hill J，Nelson E，Tilman D，et al.Environmental，E－conomic Andenergetic Costs and Benefits of Biodiesel and Ethanol Biofuels［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（30）:11206－11210.

［5］王淑軍，揚(yáng)從發(fā)，陳 靜.用于降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2001（12）:21－23.

［6］宋志萍，蔡俊鵬，曹麗芳.香蕉及茶葉中纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選［J］.現(xiàn)代食品科技，2005（21）:55－57.

［7］張秋卓，蔡偉民，馮玉杰.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶特性研究［J］.釀酒科技，2008（4）:54－57.

［8］武 崢，張迎君，周心智.降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2009，17（2）:20－26.

［9］張紀(jì)忠.微生物分類學(xué)［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，1990:220－340.