黃 勇 閆 駿 馬 敏

內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科，內蒙古呼和浩特 010050

前列腺癌是一種常見于老年男性的惡性腫瘤，在歐美等地發(fā)病率位居惡性腫瘤首位[1]。組蛋白修飾是組織細胞發(fā)育、分化基因轉錄調控的關鍵分子機制，組蛋白修飾狀態(tài)改變在腫瘤發(fā)生及進展中具有重要作用。組蛋白修飾方式包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化修飾等[2－4]，核心組蛋白乙酰化水平的穩(wěn)態(tài)是由組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白脫乙?；福℉DACs）之間的動態(tài)平衡調節(jié)的[5]。HDACs在許多異?；罨陌┘毎芯嬖?，可阻抑細胞周期抑制因子的作用。組蛋白乙?；癄顟B(tài)失衡參與眾多信號轉導通路調節(jié)，是細胞癌變中重要的轉錄后修飾過程[6]。因此，HDAC是重要的抗癌藥物靶點，在抗癌藥物研究中具有重要意義[6]。

丙戊酸（VPA）是一種HDAC抑制劑（HDACI）和抗癲癇藥物，可抑制Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白脫乙?；D移酶（HDACs）[7]。研究發(fā)現(xiàn)，長期服用VPA可減少前列腺癌癥細胞的增殖[8－10]。因此，本研究觀察了HDAC抑制劑VPA對在體前列腺癌移植體的作用，以期明確組蛋白去乙?；冈谇傲邢侔┲械淖饔眉捌錂C制。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌的細胞系LNCaP購自American Type Culture Collection（Manassas，VA），雄性無胸腺 nu/nu 小鼠（20～25 g）購自天津醫(yī)科大學實驗動物中心。L－谷氨酰胺的 RPMI 1640 培養(yǎng)基為 Cellgro（Herndon，VA）公司產品，熱滅活胎牛血清購自 Life Technologies，Inc.（Carlsbad，CA），鹽酸環(huán)丙沙星和慶大霉素購自US Biological公司（Swampscott，MA），基底膠為 BD Biosciences（Palo Alto，CA）公司產品，VPA（1 mol/L 的 VPA 鈉鹽；Sigma，St.Louis，MO）。

一抗來源：乙?；M蛋白H3為美國Upstate公司產品，p21WAF1/CIP1及雄激素受體（AR）為美國Santa Cruz公司產品，細胞周期蛋白D1為美國Ventana Medical Systems公司產品，p27KIP1為美國DAKO公司產品。

主要儀器：Leica CM 1850冰凍切片機為德國徠卡公司產品，Olympus BX51顯微鏡為日本奧林巴斯公司產品。

1.2 腫瘤細胞株培養(yǎng)及移植瘤建立

細胞培養(yǎng)環(huán)境：含L－谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基，10%熱滅活胎牛血清，5 μg/mL的鹽酸環(huán)丙沙星和50 μg/mL慶大霉素。細胞生長至鋪滿培養(yǎng)基80%～90%時，用含0.05%胰蛋白酶的EDTA（0.53 mmol/L）收集細胞，細胞重懸在PBS（pH 7.4），與混合 1×基底膠（BD Biosciences，Palo Alto，CA）混勻，皮下注入（1×106/次）雄性無胸腺nu/nu小鼠，建立腫瘤移植體。

1.3 動物分組及處理

移植瘤建立后，動物隨機分成對照組和HDAC抑制劑組，每組6只。HDAC抑制劑VPA溶于PBS，經0.22 μm過濾器滅菌，HDAC抑制劑組受試動物接受0.4%w/v的VPA飲用水，對照組為不含VPA正常飲用水，35 d后切除腫瘤。

1.4 免疫組化染色

切除腫瘤移植體經福爾馬林液固定，組織塊依次浸入10%、20%、30%的蔗糖溶液脫水，然后經OCT包埋，行連續(xù)冠狀恒冷箱切片，厚度16 μm，組織切片經水化后，3%的過氧化氫孵育 10 min，PBS沖洗（3 min×3次），滴加馬血清封閉液，孵育10 min，一抗4℃孵育過夜（一抗使用濃度：乙?；M蛋白 H3 為 1∶1000，p21WAF1/CIP1為 1∶500，細胞周期蛋白 D1 為 1∶1000，p27KIP1為 1∶1000，AR 為 1∶250），37℃復溫45 min，PBS洗 5 min×3 次，滴加相應二抗，37℃孵育 45 min，PBS沖洗，5 min×3次，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。應用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件陽性細胞進行平均光密度（MOD）分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抑制HDAC對前列腺癌移植體組蛋白H3乙酰化的影響

給予VPA飲水后，腫瘤移植體乙酰化組蛋白H3與未處理的對照組相比，陽性染色細胞數(shù)明顯增加，乙?；M蛋白H3水平顯著升高（P＜0.05），表明抑制HDAC可提高乙?；M蛋白H3的表達。見圖1、表1。

2.2 抑制HDAC對前列腺癌移植體細胞周期的影響

免疫組化檢測結果表明：給予組蛋白乙?；敢种苿￢PA后，前列腺癌移植體細胞p21WAF1/CIP1水平顯著升高（P＜0.05，圖2、表1），提示細胞周期被有效阻滯；進一步對細胞周期蛋白D1及p27KIP1的檢測結果顯示，HDAC抑制劑組D1蛋白水平與對照組相比顯著下降（P＜0.05，圖2、表1），而p27KIP1表達水平則比對照組明顯增加（P＜0.05，圖2、表1），這進一步提示，抑制HDAC可明顯阻滯細胞周期，抑制癌細胞生長。

2.3 抑制HDAC對前列腺癌移植體AR表達的影響

AR是雄激素作用的中介，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結果顯示，給予組蛋白乙酰化酶抑制劑VPA后，前列腺癌移植體細胞AR的表達水平較對照組顯著降低（P＜0.05，圖3、表1），提示抑制HDAC可通過阻斷雄激素的作用途徑抑制前列腺癌細胞發(fā)展。

表1 抑制HDAC對前列腺癌移植體各標志物免疫組化陽性染色MOD 的影響（±s，n=6）

表1 抑制HDAC對前列腺癌移植體各標志物免疫組化陽性染色MOD 的影響（±s，n=6）

注：AR：雄激素受體

組別 H3 P21WAF1/CIP1P27KIP1細胞周期蛋白D1 AR對照組HDAC抑制劑組P值0.63±0.12 0.75±0.11 0.27±0.06 0.79±0.10 0.31±0.08 1.09±0.18 0.69±0.09 0.58±0.08 0.62±0.10 0.53±0.07 0.0360.0250.020.0430.046

3 討論

以HDAC為抑制靶標的藥物可重新激活沉默的腫瘤抑制基因，并具有選擇性、多效性的抗腫瘤作用[11]。大部分人類癌癥高度異質性，可能涉及許多不同的信號通路。體外和在體研究表明，HDACI可抑制多種活性[12-14]，長期服用HDAC抑制劑VPA可顯著減少前列腺癌細胞增殖，腫瘤體積明顯減小[8]。為了進一步探討HDAC在前列腺癌作用及機制，筆者研究了HDACI對異種移植前列腺癌細胞周期和增殖相關標志物表達的影響。

細胞周期由周期蛋白和周期蛋白依賴激酶（cyclindependent kinase，CDK）的相互作用而完成。 P21WAF1/CIP1是細胞周期負調節(jié)因子家族周期蛋白依賴激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKI） 家族的一員，轉化細胞中p21WAF1/CIP1的表達對細胞周期阻滯起重要作用[15]，其可通過抑制Cyclin-CDK2復合體的活性及阻斷DNA復制阻滯細胞周期[16]。p27KIP1同樣被證實在阻滯G1期到S期細胞周期中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結果證實，抑制HDAC可促進前列腺癌移植體細胞p21WAF1/CIP1和p27KIP1表達，表明HDAC與細胞周期相關蛋白密切相關，通過抑制HDAC而上調細胞周期負調節(jié)因子家族周期蛋白依賴激酶抑制因子的表達，可抑制癌細胞增殖。

Cyclin D1是G1～S細胞周期進程中重要的正向調控因子，其可通過與CDK4/6結合形成復合體而激活后者，進而使視網膜母細胞瘤抑制基因失活，加速癌細胞周期進程[18-19]。在多種腫瘤組織中，均發(fā)現(xiàn)Cyclin D1高表達。本研究結果顯示，抑制HDAC可降低前列腺癌移植體細胞Cyclin D1表達水平，這可能是HDACI抑制癌細胞增殖的機制之一。

前列腺癌的生長是雄激素依賴性的，AR及其信號轉導通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，AR高表達可增強前列腺癌細胞對低水平雄激素的敏感性，進而導致前列腺癌在抗雄激素治療一段時間后，大多數(shù)最終發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌[20-22]。本研究表明，抑制HDAC可下調前列腺癌移植體細胞AR表達水平，這提示HDACI可通過AR信號轉導通路抑制癌細胞生長。

綜上，HDAC參與前列腺癌細胞的細胞周期調控并與AR過表達有關，HDACI可通過誘導癌細胞周期阻滯及下調AR表達水平等機制抑制前列腺癌腫瘤移植體生長，HDAC可作為前列腺癌治療藥物的研制靶標。

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