張捍軍 張 睿 李華哲 趙承斌

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科，黑龍江哈爾濱 150086

骨折是骨科臨床中最為常見的疾病，特別是隨著交通事故的頻發(fā)，骨折患者的數(shù)量也呈逐年上升的趨勢(shì)。目前，骨折的治療方式主要包括切開復(fù)位和閉合復(fù)位，但無論哪種方式都存在延遲愈合甚至不愈合的可能，給患者的身心造成極大的痛苦。針對(duì)這一問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后采用了機(jī)械固定、骨移植、電刺激、骨誘導(dǎo)等多種方法進(jìn)行治療[1-3]，雖然取得了一定的進(jìn)展，但均不能完全解決骨折不愈合的難題。本研究采用與骨代謝密切相關(guān)的降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）轉(zhuǎn)染入骨折斷端，觀察其對(duì)骨折動(dòng)物模型的愈合作用，在基因水平為促進(jìn)骨折的愈合提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

36只 SD大鼠，平均體重（200±10）g，由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，許可證號(hào)：SYXK （黑）2006-032；pcDNA3.1-CGRP 質(zhì)粒（Invitrogen，美國(guó)），E.coli.DH5α（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供），CGRP引物、dNTP（TAKARA，日本），Hind Ⅲ、BamHⅠ（博士德公司，中國(guó)武漢），兔抗大鼠CGRP單克隆抗體、生物素二抗、AP二抗（博士德公司，中國(guó)武漢）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 應(yīng)用CaCl2溶液將E.coli.DH5α制備成感受態(tài)E.coli.DH5α，加入到 50 mL離心管中，向離心管中加入 5 μL pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒，冰浴 30 min，42℃熱休克 90 s，再冰浴 2 min。向管中加入SOC培養(yǎng)基800 μL，37℃培養(yǎng) 45 min，使恢復(fù)大腸桿菌的正常生長(zhǎng)狀態(tài)并且表達(dá)抗生素的抗性基因。將菌液涂于含有50 μg/mL氨芐青霉素的SOB平板上進(jìn)行抗性篩選。

1.2.2 CGRP的PCR及酶切鑒定 待菌落長(zhǎng)出后，挑選飽滿菌落對(duì)CGRP行PCR檢測(cè)，向體系內(nèi)加入5×PCR Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各 1 μL（表1），Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，加 ddH2O 定容至 20 μL。 95℃變性 60 s，60℃復(fù)性 60 s，72℃延伸 60 s，30 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸 5 min，4℃保溫。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。對(duì)于PCR鑒定陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增提取質(zhì)粒后，加入 10×K Buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL，BamHⅠ1 μL， 質(zhì)粒-PCR 混合物 15 μL，ddH2O定容至 20 μL，37℃反應(yīng) 8 h后進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 聚合酶鏈反應(yīng)引物列表

1.2.3 pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒溶液的配制 選取pcDNA3.1-CGRP鑒定為陽(yáng)性克隆菌株，擴(kuò)增后應(yīng)用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取質(zhì)粒，0.22 μm濾器除菌干燥后加入到含20%蔗糖的PBS溶液中，配制成濃度為1.0 g/L的pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒溶液，同時(shí)配制1.0 g/L的單純pcDNA3.1質(zhì)粒溶液，-20℃保存待用。

1.2.4 動(dòng)物的分組及模型制備 36只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C 3 組，每組 12 只，3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔麻醉，右下肢常規(guī)備皮消毒后，切開皮膚及皮下組織，分離暴露股骨，于股骨中點(diǎn)處用擺鋸將股骨橫行鋸斷，克氏針固定后逐層縫合。術(shù)后24、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，A組每只動(dòng)物于骨折處經(jīng)皮注入pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒溶液1 mL，B組注入單純pcDNA3.1質(zhì)粒溶液1 mL，C組注入PBS溶液1 mL作為陰性對(duì)照。于術(shù)后2、4周檢測(cè)骨折愈合情況。

1.2.5 骨折端的X線檢查 于術(shù)后觀察大鼠一般狀態(tài)及切口情況，對(duì)每組動(dòng)物均進(jìn)行X線檢查，記錄骨折復(fù)位情況。分別在2、4周時(shí)每組分別選取6只大鼠，在X線下觀察骨折斷端骨痂的形成情況，并與術(shù)后進(jìn)行比較。

1.2.6 CGRP的免疫組化檢測(cè) 術(shù)后2、4周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各隨機(jī)選取6只大鼠，乙醚麻醉后處死，取骨折端周圍骨組織、骨膜組織和骨骼肌，4%多聚甲醛固定后，骨組織EDTA脫鈣處理。切片脫蠟后，3%H2O2浸泡20 min，加入兔抗大鼠 CGRP單克隆抗體（1∶200），室溫過夜；PBS沖洗，加入生物素二抗（1∶400），37 ℃孵育 30 min；PBS 沖洗后加入新配制DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取6張切片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 CGRP的 Western blot檢測(cè) 術(shù)后 2、4周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取處死動(dòng)物的骨膜組織，加入1 mL細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min，經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎儀粉碎后，4℃低溫離心10 min（12 000 r/min），取上清加入 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液電泳。轉(zhuǎn)膜封閉后，加入兔抗大鼠CGRP單克隆抗體（1∶200），室溫過夜；TBST 沖洗后加入 AP 標(biāo)記的二抗（1∶400），孵育1 h，加AP顯色液顯色。應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，PCR、免疫組化及Western blot的檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CGRP的PCR及酶切鑒定

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，對(duì)飽滿菌落PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，有4個(gè)克隆菌落在成像儀下可見大小相同的特異性片段，與CGRP的cDNA相吻合。對(duì)這4個(gè)克隆菌落提取質(zhì)粒酶切后進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀下可見兩條特異性條帶，其大小分別與pcDNA3.1和CGRP相一致。

2.2 骨折端的X線檢查

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后一般狀態(tài)良好，切口無感染，右下肢跛行。術(shù)后行X線檢測(cè)，各組動(dòng)物骨折端對(duì)位對(duì)線良好，橫行骨折線清晰可見。術(shù)后2周時(shí)，A組動(dòng)物可見明顯的骨性骨痂形成，B、C組骨性骨痂不明顯；術(shù)后4周時(shí)，A組動(dòng)物骨折端均已骨性愈合，骨折線消失，2只動(dòng)物出現(xiàn)骨髓腔再通，其余四肢尚未再通，B、C組動(dòng)物可見骨性骨痂形成，骨折線模糊，其中B組1只動(dòng)物未見骨痂形成。

2.3 CGRP的免疫組化檢測(cè)

術(shù)后2周時(shí)，A、B、C三組切片均可見CGRP的陽(yáng)性表達(dá)，骨、骨膜、骨骼肌的CGRP平均光密度值見表2。A組的CGRP表達(dá)水平均高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明CGRP基因在A組不同組織均有轉(zhuǎn)染；A組CGRP的表達(dá)水平在骨膜組織明顯高于骨組織和骨骼肌組織，說明CGRP基因在骨膜組織的轉(zhuǎn)染率較高。術(shù)后4周時(shí)，A組CGRP 表達(dá)較 2周時(shí)明顯下降（P ＜ 0.05，圖1）；B、C 組未見CGRP表達(dá)。

表2 術(shù)后2周時(shí)CGRP的免疫組化光密度值（±s）

表2 術(shù)后2周時(shí)CGRP的免疫組化光密度值（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù) 骨 骨膜 骨骼肌A組60.301±0.0150.415±0.0330.283±0.029 B組60.143±0.009*0.162±0.017*0.105±0.013*C組60.126±0.007*0.148±0.032*0.098±0.003*

圖1 術(shù)后2、4周時(shí)A組CGRP平均光密度值比較

2.4 CGRP的Western blot檢測(cè)

Western blot檢測(cè)采用管家基因GAPDH作為內(nèi)參，電泳條帶亮度一致，三組蛋白形成的CGRP條帶密度不同。根據(jù)公式：CGRP相對(duì)量=CGRPF產(chǎn)物電泳條帶密度/GAPDH×100%，計(jì)算各組蛋白量，結(jié)果見表3。A組動(dòng)物CGRP的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)較B、C組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），B、C 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

表3 三組 CGRP蛋白表達(dá)相對(duì)量比較（±s）

表3 三組 CGRP蛋白表達(dá)相對(duì)量比較（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05

術(shù)后2周 術(shù)后4周組別 只數(shù) 相對(duì)量 只數(shù) 相對(duì)量A組60.438±0.02660.367±0.033 B組60.186±0.009*60.107±0.043*C組60.173±0.011*60.152±0.033*

3 討論

骨折是骨科最為常見的疾病之一[4]，多數(shù)由意外所致，給患者身心造成極大痛苦，如何提高骨折愈合時(shí)間，恢復(fù)患者的正常生活是創(chuàng)傷骨科臨床中面臨的重要問題之一[5]。對(duì)于骨折延遲愈合甚至不愈合，許多學(xué)者采用不同方法均取得一定療效[6-8]，但并未能完全解決這一難題。骨折的愈合是較為復(fù)雜的病理生理過程，在細(xì)胞水平涉及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的參與[9]；在分子水平又涉及多種細(xì)胞因子、炎癥因子的相互作用[10]。其中，由于CGRP參與骨代謝的過程，在骨折的愈合過程中顯得尤為重要。

CGRP最早發(fā)現(xiàn)于甲狀腺髓樣癌組織中，主要分布于感覺神經(jīng)纖維，通過軸漿運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)末梢[11]。骨折發(fā)生后，隨著骨折的愈合，周圍神經(jīng)逐漸長(zhǎng)入骨折斷端，其中以CGRP陽(yáng)性纖維居多[12]。本研究通過基因轉(zhuǎn)染方式，將外源性基因片段導(dǎo)入骨折斷端，使其在體內(nèi)表達(dá)。質(zhì)粒溶液導(dǎo)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)染效率雖然沒有病毒溶液高，但由于CGRP在10-8～10-9mol/L水平即能發(fā)揮作用，因此，本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)染，是一種方便快捷的轉(zhuǎn)染方式。A組CGRP在骨、骨膜、骨骼肌組織中的表達(dá)水平均明顯高于B、C組，說明CGRP在體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功并形成有效的表達(dá)。本研究A組CGRP在骨膜中的含量高于骨組織和骨骼肌組織，證明外源性CGRP在骨膜組織中的轉(zhuǎn)染率高，這與內(nèi)源性CGRP的分布水平相一致，是由于CGRP能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性，所以分布于骨膜等成骨活躍的區(qū)域[13]。術(shù)后2周時(shí)CGRP在骨膜內(nèi)的含量明顯高于4周時(shí)，說明CGRP主要在成骨的早期發(fā)揮作用，而在骨痂形成后的塑性期，其作用減弱。術(shù)后4周時(shí)，A組的CGRP表達(dá)仍較B、C組高，說明轉(zhuǎn)染的外源性基因表達(dá)較持久。雖然B、C組沒有外源性CGRP的轉(zhuǎn)染，但在骨折愈合的早期和晚期仍有CGRP的表達(dá)，可見內(nèi)源性CGRP在骨折周圍組織中也有表達(dá)，而早期的表達(dá)水平高于晚期的動(dòng)態(tài)變化，也說明了內(nèi)源性CGRP在骨折愈合的過程中發(fā)揮一定的作用。CGRP發(fā)揮作用的通路可能與蛋白激酶 C（PKC）有關(guān)[14]，也有研究表明其可能是通過抑制核因子κB活化因子配體（RANKL）對(duì)NF-κB的激活作用而起效[15]。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于未能探究CGRP的具體作用通路及作用位點(diǎn)，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，降鈣素基因相關(guān)肽能夠加速骨痂形成，提高骨折的愈合效率。

[1]魏均強(qiáng)，張伯勛，陳華，等.萎縮性骨折不愈合的研究新進(jìn)展[J].中國(guó)骨傷，2012，25（12）：1053-1056.

[2]Vulpiani MC，Vetrano M，Conforti F，et al.Effects of extracorporeal shock wave therapy on fracture nonunions[J].Am J Orthop，2012，41（9）：122-127.

[3]左健，康建敏，潘樂，等.同種異體骨移植用于骨缺損修復(fù)的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國(guó)組織工程研究，2012，16（18）：3395-3398.

[4]崔巍，史勇，陶衛(wèi)建，等.切開復(fù)位內(nèi)固定治療跟骨移位關(guān)節(jié)內(nèi)骨折的效果觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（3）：72-74.

[5]Sakoguchi K，Minami H，Suzuki S，et al.Evaluation of fracture resistance of indirect composite resin crowns by cyclic impact test：Influence of crown and abutment materials [J].Dent Mater J，2013，32（3）：433-440.

[6]Yao JF，Shen JZ，Li DK，et al.Rap system of stress stimulation can promote bone union after lower tibial bone fracture：a clinical research[J].Int J Med Sci，2012，9（6）：462-466.

[7]Oduwole KO，Cichy B，Dillon JP，et al.Acutrak versus Herbert screw fixation for scaphoid non-union and delayed union [J].J Orthop Surg，2012，20（1）：61-65.

[8]Kaipel M，Schützenberger S，Schultz A，et al.BMP-2 but not VEGF or PDGF in fibrin matrix supports bone healing in a delayed-union rat model[J].J Orthop Res，2012，30（10）：1563-1569.

[9]Loiselle AE，Paul EM，Lewis GS，et al.Osteoblast and osteocyte-specific loss of Connexin43 results in delayed bone formation and healing during murine fracture healing [J].J Orthop Res，2013，31（1）：147-154.

[10]Bragdon B，Thinakaran S，Moseychuk O，et al.Casein kinase 2 regulates in vivo bone formation through its interaction with bone morphogenetic protein receptor type Ia[J].Bone，2011，49（5）：944-954.

[11]盧政好，詹瑞森，孫雙喜，等.早期SANFH大鼠骨組織中CGRP免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維的變化及意義[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2010，12（7）：872-875.

[12]王曉云，郭霞，錢忠明，等.骨組織中降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)的分布及生理作用[J].中華骨科雜志，2005，25（3）：185-188.

[13]Park SH，Sim YB，Kim CH，et al.Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice [J].Peptides，2013，44：158-162.

[14]Hong Y，Wang D，Chabot JG，et al.A role for protein kinase C-dependent upregulation of adrenomedullin in the development of morphine tolerance in male rats[J].J Neurosci，2010，30（37）：12508-12516.

[15]Wang L，Shi X，Zhao R，et al.Calcitonin-gene-related peptide stimulates stromal cell osteogenic differentiation and inhibits RANKL induced NF-kappaB activation，osteoclastogenesis and bone resorption[J].Bone，2010，46（5）：1369-1379.