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        降鈣素基因相關(guān)肽介導(dǎo)骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究

        2013-10-17 06:03:08張捍軍李華哲趙承斌

        張捍軍 張 睿 李華哲 趙承斌

        哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科,黑龍江哈爾濱 150086

        骨折是骨科臨床中最為常見的疾病,特別是隨著交通事故的頻發(fā),骨折患者的數(shù)量也呈逐年上升的趨勢(shì)。目前,骨折的治療方式主要包括切開復(fù)位和閉合復(fù)位,但無論哪種方式都存在延遲愈合甚至不愈合的可能,給患者的身心造成極大的痛苦。針對(duì)這一問題,國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后采用了機(jī)械固定、骨移植、電刺激、骨誘導(dǎo)等多種方法進(jìn)行治療[1-3],雖然取得了一定的進(jìn)展,但均不能完全解決骨折不愈合的難題。本研究采用與骨代謝密切相關(guān)的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)轉(zhuǎn)染入骨折斷端,觀察其對(duì)骨折動(dòng)物模型的愈合作用,在基因水平為促進(jìn)骨折的愈合提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        36只 SD大鼠,平均體重(200±10)g,由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供,許可證號(hào):SYXK (黑)2006-032;pcDNA3.1-CGRP 質(zhì)粒(Invitrogen,美國(guó)),E.coli.DH5α(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供),CGRP引物、dNTP(TAKARA,日本),Hind Ⅲ、BamHⅠ(博士德公司,中國(guó)武漢),兔抗大鼠CGRP單克隆抗體、生物素二抗、AP二抗(博士德公司,中國(guó)武漢)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 應(yīng)用CaCl2溶液將E.coli.DH5α制備成感受態(tài)E.coli.DH5α,加入到 50 mL離心管中,向離心管中加入 5 μL pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒,冰浴 30 min,42℃熱休克 90 s,再冰浴 2 min。向管中加入SOC培養(yǎng)基800 μL,37℃培養(yǎng) 45 min,使恢復(fù)大腸桿菌的正常生長(zhǎng)狀態(tài)并且表達(dá)抗生素的抗性基因。將菌液涂于含有50 μg/mL氨芐青霉素的SOB平板上進(jìn)行抗性篩選。

        1.2.2 CGRP的PCR及酶切鑒定 待菌落長(zhǎng)出后,挑選飽滿菌落對(duì)CGRP行PCR檢測(cè),向體系內(nèi)加入5×PCR Buffer 4 μL,dNTP 1 μL,上下游引物各 1 μL(表1),Taq DNA 聚合酶 0.2 μL,加 ddH2O 定容至 20 μL。 95℃變性 60 s,60℃復(fù)性 60 s,72℃延伸 60 s,30 個(gè)循環(huán)后,72℃延伸 5 min,4℃保溫。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。對(duì)于PCR鑒定陽(yáng)性菌落,擴(kuò)增提取質(zhì)粒后,加入 10×K Buffer 2 μL,Hind Ⅲ 1 μL,BamHⅠ1 μL, 質(zhì)粒-PCR 混合物 15 μL,ddH2O定容至 20 μL,37℃反應(yīng) 8 h后進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

        表1 聚合酶鏈反應(yīng)引物列表

        1.2.3 pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒溶液的配制 選取pcDNA3.1-CGRP鑒定為陽(yáng)性克隆菌株,擴(kuò)增后應(yīng)用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取質(zhì)粒,0.22 μm濾器除菌干燥后加入到含20%蔗糖的PBS溶液中,配制成濃度為1.0 g/L的pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒溶液,同時(shí)配制1.0 g/L的單純pcDNA3.1質(zhì)粒溶液,-20℃保存待用。

        1.2.4 動(dòng)物的分組及模型制備 36只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C 3 組,每組 12 只,3.5%水合氯醛(1 mL/100g)腹腔麻醉,右下肢常規(guī)備皮消毒后,切開皮膚及皮下組織,分離暴露股骨,于股骨中點(diǎn)處用擺鋸將股骨橫行鋸斷,克氏針固定后逐層縫合。術(shù)后24、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),A組每只動(dòng)物于骨折處經(jīng)皮注入pcDNA3.1-CGRP質(zhì)粒溶液1 mL,B組注入單純pcDNA3.1質(zhì)粒溶液1 mL,C組注入PBS溶液1 mL作為陰性對(duì)照。于術(shù)后2、4周檢測(cè)骨折愈合情況。

        1.2.5 骨折端的X線檢查 于術(shù)后觀察大鼠一般狀態(tài)及切口情況,對(duì)每組動(dòng)物均進(jìn)行X線檢查,記錄骨折復(fù)位情況。分別在2、4周時(shí)每組分別選取6只大鼠,在X線下觀察骨折斷端骨痂的形成情況,并與術(shù)后進(jìn)行比較。

        1.2.6 CGRP的免疫組化檢測(cè) 術(shù)后2、4周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各隨機(jī)選取6只大鼠,乙醚麻醉后處死,取骨折端周圍骨組織、骨膜組織和骨骼肌,4%多聚甲醛固定后,骨組織EDTA脫鈣處理。切片脫蠟后,3%H2O2浸泡20 min,加入兔抗大鼠 CGRP單克隆抗體(1∶200),室溫過夜;PBS沖洗,加入生物素二抗(1∶400),37 ℃孵育 30 min;PBS 沖洗后加入新配制DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取6張切片,每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野,應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        1.2.7 CGRP的 Western blot檢測(cè) 術(shù)后 2、4周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),取處死動(dòng)物的骨膜組織,加入1 mL細(xì)胞裂解液,冰上裂解5 min,經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎儀粉碎后,4℃低溫離心10 min(12 000 r/min),取上清加入 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液電泳。轉(zhuǎn)膜封閉后,加入兔抗大鼠CGRP單克隆抗體(1∶200),室溫過夜;TBST 沖洗后加入 AP 標(biāo)記的二抗(1∶400),孵育1 h,加AP顯色液顯色。應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS 18.0采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,PCR、免疫組化及Western blot的檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 CGRP的PCR及酶切鑒定

        質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后,對(duì)飽滿菌落PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,有4個(gè)克隆菌落在成像儀下可見大小相同的特異性片段,與CGRP的cDNA相吻合。對(duì)這4個(gè)克隆菌落提取質(zhì)粒酶切后進(jìn)行電泳,在凝膠成像儀下可見兩條特異性條帶,其大小分別與pcDNA3.1和CGRP相一致。

        2.2 骨折端的X線檢查

        實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后一般狀態(tài)良好,切口無感染,右下肢跛行。術(shù)后行X線檢測(cè),各組動(dòng)物骨折端對(duì)位對(duì)線良好,橫行骨折線清晰可見。術(shù)后2周時(shí),A組動(dòng)物可見明顯的骨性骨痂形成,B、C組骨性骨痂不明顯;術(shù)后4周時(shí),A組動(dòng)物骨折端均已骨性愈合,骨折線消失,2只動(dòng)物出現(xiàn)骨髓腔再通,其余四肢尚未再通,B、C組動(dòng)物可見骨性骨痂形成,骨折線模糊,其中B組1只動(dòng)物未見骨痂形成。

        2.3 CGRP的免疫組化檢測(cè)

        術(shù)后2周時(shí),A、B、C三組切片均可見CGRP的陽(yáng)性表達(dá),骨、骨膜、骨骼肌的CGRP平均光密度值見表2。A組的CGRP表達(dá)水平均高于B、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明CGRP基因在A組不同組織均有轉(zhuǎn)染;A組CGRP的表達(dá)水平在骨膜組織明顯高于骨組織和骨骼肌組織,說明CGRP基因在骨膜組織的轉(zhuǎn)染率較高。術(shù)后4周時(shí),A組CGRP 表達(dá)較 2周時(shí)明顯下降(P < 0.05,圖1);B、C 組未見CGRP表達(dá)。

        表2 術(shù)后2周時(shí)CGRP的免疫組化光密度值(±s)

        表2 術(shù)后2周時(shí)CGRP的免疫組化光密度值(±s)

        注:與A組比較,*P<0.05

        組別 只數(shù) 骨 骨膜 骨骼肌A組60.301±0.0150.415±0.0330.283±0.029 B組60.143±0.009*0.162±0.017*0.105±0.013*C組60.126±0.007*0.148±0.032*0.098±0.003*

        圖1 術(shù)后2、4周時(shí)A組CGRP平均光密度值比較

        2.4 CGRP的Western blot檢測(cè)

        Western blot檢測(cè)采用管家基因GAPDH作為內(nèi)參,電泳條帶亮度一致,三組蛋白形成的CGRP條帶密度不同。根據(jù)公式:CGRP相對(duì)量=CGRPF產(chǎn)物電泳條帶密度/GAPDH×100%,計(jì)算各組蛋白量,結(jié)果見表3。A組動(dòng)物CGRP的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)較B、C組均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),B、C 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。

        表3 三組 CGRP蛋白表達(dá)相對(duì)量比較(±s)

        表3 三組 CGRP蛋白表達(dá)相對(duì)量比較(±s)

        注:與A組比較,*P<0.05

        術(shù)后2周 術(shù)后4周組別 只數(shù) 相對(duì)量 只數(shù) 相對(duì)量A組60.438±0.02660.367±0.033 B組60.186±0.009*60.107±0.043*C組60.173±0.011*60.152±0.033*

        3 討論

        骨折是骨科最為常見的疾病之一[4],多數(shù)由意外所致,給患者身心造成極大痛苦,如何提高骨折愈合時(shí)間,恢復(fù)患者的正常生活是創(chuàng)傷骨科臨床中面臨的重要問題之一[5]。對(duì)于骨折延遲愈合甚至不愈合,許多學(xué)者采用不同方法均取得一定療效[6-8],但并未能完全解決這一難題。骨折的愈合是較為復(fù)雜的病理生理過程,在細(xì)胞水平涉及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的參與[9];在分子水平又涉及多種細(xì)胞因子、炎癥因子的相互作用[10]。其中,由于CGRP參與骨代謝的過程,在骨折的愈合過程中顯得尤為重要。

        CGRP最早發(fā)現(xiàn)于甲狀腺髓樣癌組織中,主要分布于感覺神經(jīng)纖維,通過軸漿運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)末梢[11]。骨折發(fā)生后,隨著骨折的愈合,周圍神經(jīng)逐漸長(zhǎng)入骨折斷端,其中以CGRP陽(yáng)性纖維居多[12]。本研究通過基因轉(zhuǎn)染方式,將外源性基因片段導(dǎo)入骨折斷端,使其在體內(nèi)表達(dá)。質(zhì)粒溶液導(dǎo)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)染效率雖然沒有病毒溶液高,但由于CGRP在10-8~10-9mol/L水平即能發(fā)揮作用,因此,本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)染,是一種方便快捷的轉(zhuǎn)染方式。A組CGRP在骨、骨膜、骨骼肌組織中的表達(dá)水平均明顯高于B、C組,說明CGRP在體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功并形成有效的表達(dá)。本研究A組CGRP在骨膜中的含量高于骨組織和骨骼肌組織,證明外源性CGRP在骨膜組織中的轉(zhuǎn)染率高,這與內(nèi)源性CGRP的分布水平相一致,是由于CGRP能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性,所以分布于骨膜等成骨活躍的區(qū)域[13]。術(shù)后2周時(shí)CGRP在骨膜內(nèi)的含量明顯高于4周時(shí),說明CGRP主要在成骨的早期發(fā)揮作用,而在骨痂形成后的塑性期,其作用減弱。術(shù)后4周時(shí),A組的CGRP表達(dá)仍較B、C組高,說明轉(zhuǎn)染的外源性基因表達(dá)較持久。雖然B、C組沒有外源性CGRP的轉(zhuǎn)染,但在骨折愈合的早期和晚期仍有CGRP的表達(dá),可見內(nèi)源性CGRP在骨折周圍組織中也有表達(dá),而早期的表達(dá)水平高于晚期的動(dòng)態(tài)變化,也說明了內(nèi)源性CGRP在骨折愈合的過程中發(fā)揮一定的作用。CGRP發(fā)揮作用的通路可能與蛋白激酶 C(PKC)有關(guān)[14],也有研究表明其可能是通過抑制核因子κB活化因子配體(RANKL)對(duì)NF-κB的激活作用而起效[15]。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于未能探究CGRP的具體作用通路及作用位點(diǎn),尚需進(jìn)一步研究。

        綜上所述,降鈣素基因相關(guān)肽能夠加速骨痂形成,提高骨折的愈合效率。

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