王懷志 趙國(guó)強(qiáng) 石獻(xiàn)洲 汪 海 張 建 李懷洲

1.武警河南省總隊(duì)醫(yī)院普通外科，河南鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450052

在我國(guó)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均較高[1－2]，因此，結(jié)腸癌的治療對(duì)于民生具有重要的意義。奧沙利鉑（Oxaliplatin，L－OHP）是一種鉑類化療藥物，是治療結(jié)腸癌的一線化療藥物。但是結(jié)腸癌細(xì)胞容易對(duì)L－OHP產(chǎn)生耐藥性，這是結(jié)腸癌化療失敗的主要原因之一[3]。許多研究對(duì)這一現(xiàn)象及其機(jī)制進(jìn)行了探討[4－5]，但是腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是否參與了這一過(guò)程并不清楚。本研究以L－OHP為誘導(dǎo)劑，建立了人結(jié)腸癌L－OHP耐藥細(xì)胞株，觀察了腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，以探討CSC在結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L－OHP產(chǎn)生獲得性耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29購(gòu)自南京凱基科技生物發(fā)展有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；L－OHP購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；As2O3購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HT29的耐藥株和親本株均采用RPMI 1640（含10%的小牛血清）培養(yǎng)，于恒溫37℃且含有5%體積CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 人結(jié)腸癌耐L-OHP細(xì)胞株的誘導(dǎo)

采用藥物濃度遞增和間歇誘導(dǎo)相結(jié)合的方法誘導(dǎo)人結(jié)腸癌耐L－OHP細(xì)胞株。L－OHP濃度從4 μmol/L開(kāi)始最終增加到 16 μmol/L，最終獲得可耐受 16 μmol/L L－OHP的細(xì)胞HT29細(xì)胞株，命名為HT29/L－OHP，維持培養(yǎng)于含4 μmol/L L－OHP的正常培養(yǎng)液中，后續(xù)實(shí)驗(yàn)前1周撤藥。

1.2.3 MTT法

MTT是一種染料，在活細(xì)胞的作用下，外源性的MTT被線粒體中的琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色結(jié)晶物，采用二甲基亞砜溶解此結(jié)晶物后，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，可以根據(jù)此光密度值間接推算活細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29及HT29/L－OHP細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×104/mL，接種于96孔板中，MTT法測(cè)定每孔的吸光度（OD值），連續(xù)測(cè)定7 d，繪制生長(zhǎng)曲線。 倍增時(shí)間計(jì)算公式如下：TD=T×lg2/lg（Nt/N0），其中，TD為倍增時(shí)間（h），T為細(xì)胞數(shù)目由N0增殖到至Nt所用的時(shí)間。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為三組：HT29/L－OHP+L－OHP 組（12 μmol/L L－OHP 處理 的 HT29/L－OHP 細(xì) 胞 ），HT29+L－OHP 組（12 μmol/L L－OHP 處理的 HT29 細(xì)胞），HT29 組（無(wú) L－OHP的HT29細(xì)胞）。

1.2.5 HT29和HT29/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP敏感性的測(cè)定

將HT29及HT29/L－OHP細(xì)胞接種于96孔板中，采用不同濃度的 L－OHP 處理，所用濃度分別為 0.1、1、10、100、1000 μmol/L。培養(yǎng)72 h后測(cè)定每孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率、半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.6 As2O3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將HT29及HT29/L－OHP細(xì)胞接種于96孔板中，采用不同濃度的As2O3處理細(xì)胞，所用濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。培養(yǎng)72 h后測(cè)定每孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞抑制率。 細(xì)胞抑制率=[1－（AX－A）/（A0－A）]×100%，其中，AX為加藥組的OD值，A0為空白對(duì)照組的OD值，A為單純培養(yǎng)液組的OD值。

1.2.7 As2O3對(duì)HT29/L-OHP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)

根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取無(wú)細(xì)胞毒劑量的As2O3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入As2O372 h后測(cè)定HT29/L－OHP細(xì)胞對(duì)L－OHP的敏感性，計(jì)算IC50，并計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)和相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=HT29/L－OHP的IC50/加入As2O3后HT29/L－OHP 的 IC50。 相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率=（HT29/L－OHP 逆轉(zhuǎn)前IC50－ HT29/L－OHP逆轉(zhuǎn)后 IC50）/（ HT29/L－OHP逆轉(zhuǎn)前IC50－ HT 的 IC50）。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.8.1 引物設(shè)計(jì) 采用引物在線軟件設(shè)計(jì)引物并檢測(cè)分析（blast.ncbi.nlm.nih.gov），最后由上海生物工程有限公司合成，引物序列（5'→3'）見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增引物及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.8.2 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥株和親本株HT29細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到的cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2.8.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×） 10 μL，F(xiàn)orword primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL。 反應(yīng)條件：95℃變性 15 min，擴(kuò)增 40循環(huán)，每循環(huán)變性 15 s，60℃退火 30 s，72℃ 30 s。 采用△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性分析和正態(tài)分布檢驗(yàn)，方差齊且呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析；方差不齊或者非正態(tài)分布數(shù)據(jù)均進(jìn)行變量變換，變換后再進(jìn)行方差齊性分析和正態(tài)分布檢驗(yàn)，若變換后仍方差不齊或者非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HT29/L-OHP的鑒定

MTT 結(jié)果顯示，L－OHP（12 μmol/L）存在的情況下，在第1、2天時(shí)，HT29/L－OHP和HT29細(xì)胞的增殖速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），但是在第 3～7 天，HT29/L－OHP細(xì)胞增殖速度顯著高于HT29細(xì)胞（P＜0.01）（圖1）。HT29/L－OHP細(xì)胞的倍增時(shí)間為28.7 h，低于HT29細(xì)胞（45.1 h）。同無(wú)L－OHP作用的HT29細(xì)胞相比，HT29/L－OHP細(xì)胞的增殖速度無(wú)顯著改變（P ＞ 0.05）（圖1），HT29/L－OHP 細(xì)胞的倍增時(shí)間接近于無(wú)L－OHP作用的HT29細(xì)胞（26.3 h）。MTT結(jié)果顯示，HT29/L－OHP 細(xì)胞的 IC50為 138.4 μmol/L，HT29細(xì)胞的 IC50為 12.1 μmol/L，RI為 11.44。

2.2 As2O3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，0.25 mg/L的As2O3對(duì)HT29細(xì)胞無(wú)毒性反應(yīng)，但是當(dāng)濃度超過(guò)0.25 mg/L時(shí)，As2O3呈現(xiàn)出劑量依賴性的毒性效應(yīng)（表2），可以認(rèn)為0.20 mg/L的As2O3為無(wú)細(xì)胞毒性劑量。

表2 不同濃度As2O3的細(xì)胞毒性測(cè)定（±s）

表2 不同濃度As2O3的細(xì)胞毒性測(cè)定（±s）

As2O3（mg/L）0.25抑制率（%）HT29 HT29/L－OHP 0.5 124 0.07±0.02 0.29±0.06 0.46±0.10 0.63±0.11 0.87±0.09 0.06±0.02 0.26±0.05 0.42±0.09 0.54±0.10 0.81±0.08

2.3 As2O3對(duì)HT29/L-OHP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)

As2O3（0.20 mg/L）預(yù)處理后，MTT 結(jié)果顯示，在 L－OHP（12 μmol/L） 存在的情況下，在第 1～5 天時(shí)，HT29/L－OHP 和HT29細(xì)胞的增殖速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2），但是在第6、7天，HT29/L－OHP細(xì)胞增殖速度顯著高于HT29細(xì)胞（P ＜ 0.05，圖2）；統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，HT29/L－OHP 細(xì)胞的倍增時(shí)間為39.8 h，與HT29細(xì)胞倍增時(shí)間的差距減?。?6.3 h）。結(jié)果還表明，同無(wú)L－OHP作用的HT29細(xì)胞相比，在第1、2天時(shí)，HT29/L－OHP細(xì)胞的增殖速度無(wú)顯著改變（P ＞ 0.05，圖2），但是在第 3～7 天，HT29/L－OHP 細(xì)胞的增殖速度降低（P＜0.05，圖2），其倍增時(shí)間高于無(wú)L－OHP作用的HT29細(xì)胞（28.6 h）。MTT結(jié)果還表明，As2O3（0.20 mg/L）預(yù)處理后，HT29/L－OHP 細(xì)胞的 IC50為 36.8 μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.76，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為80.4%。

2.4 Sox-2、miR-200c和 let-7的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，相對(duì)于HT29細(xì)胞，HT29/L－OHP細(xì)胞的Sox－2的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01），但是mir－200c 和 let－7 的表達(dá)顯著下降（P ＜ 0.05）；As2O3（0.20 mg/L）預(yù)處理后，相對(duì)于逆轉(zhuǎn)之前的HT29/L－OHP細(xì)胞，HT29/L－OHP細(xì)胞中 Sox－2的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），mir－200c和 let－7 的表達(dá)顯著升高（P ＜ 0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 各組間Sox-2、miR-200c和let-7基因表達(dá)情況（±s）

表3 各組間Sox-2、miR-200c和let-7基因表達(dá)情況（±s）

注：與 HT29組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 HT29/L－OHP 組比較，#P＜0.05

組別 Sox－2 miR－200c let－7 HT29組HT29/L－OHP 組As2O3+HT29/L－OHP 組0.019±0.010 0.072±0.038**0.032±0.012#0.726±0.289 0.262±0.136*0.367±0.256#0.642±0.268 0.213±0.145*0.3869±0.253#

3 討論

本研究首先采用藥物濃度遞增和間歇誘導(dǎo)相結(jié)合的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生了人結(jié)腸癌HT29/L－OHP耐藥細(xì)胞株。生長(zhǎng)曲線分析表明，在L－OHP的作用下，HT29/L－OHP細(xì)胞的增殖速度顯著高于HT29細(xì)胞，說(shuō)明HT29/L－OHP細(xì)胞對(duì)L－OHP的耐受性顯著高于HT29細(xì)胞。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，同未經(jīng)L－OHP作用的HT29細(xì)胞相比，L－OHP作用下的HT29/L－OHP細(xì)胞的增殖速度未見(jiàn)顯著降低，說(shuō)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)后，HT29/L－OHP細(xì)胞恢復(fù)了增殖能力。L－OHP敏感性測(cè)定結(jié)果表明，HT29/L－OHP細(xì)胞的IC50高于HT29細(xì)胞，RI為 11.44，說(shuō)明 HT29/L－OHP 細(xì)胞對(duì) L－OHP 高度耐藥[6]。綜合以上結(jié)果，本研究成功建立了能夠在L－OHP作用下穩(wěn)定生長(zhǎng)的HT29/L－OHP耐藥細(xì)胞株。

多項(xiàng)研究表明，CSC是多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療藥物耐藥性的重要機(jī)制之一[7－8]，但是CSC在結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L－OHP耐藥中的作用并不清楚。為了探討CSC是否參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察了與干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物的表達(dá)。Sox－2是一種具有很強(qiáng)特異性的胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物，在干細(xì)胞中的表達(dá)較強(qiáng)[9－10]。miR－200c和let－7是兩種微小RNA，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和分化等過(guò)程密切相關(guān)，在CSC中表現(xiàn)為低表達(dá)[11－12]。本研究中，相對(duì)于HT29細(xì)胞，HT29/L－OHP細(xì)胞Sox－2的表達(dá)顯著增加，而miR－200c和let－7的表達(dá)顯著下降，說(shuō)明誘導(dǎo)HT29細(xì)胞獲得對(duì)L－OHP的耐藥性后，HT29/LOHP細(xì)胞的干細(xì)胞特性增強(qiáng)。

為了進(jìn)一步研究CSC的作用，本研究采用As2O3逆轉(zhuǎn)了HT29/L－OHP細(xì)胞的耐藥性，觀察了干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物的表達(dá)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，在劑量超過(guò)0.25 mg/L時(shí)，As2O3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系表現(xiàn)出劑量依賴性的毒性效應(yīng)，筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，0.20 mg/L的As2O3對(duì)HT29細(xì)胞和HT29/L－OHP細(xì)胞均無(wú)毒性效應(yīng)。因此，可以認(rèn)為0.20 mg/L的As2O3為無(wú)細(xì)胞毒性劑量，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。0.20 mg/L As2O3處理72 h后，HT29/L－OHP細(xì)胞的增殖速度和 IC50均顯著降低，表明成功逆轉(zhuǎn)了HT29/L－OHP細(xì)胞的耐藥性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，As2O3處理后，同未處理前相比，HT29/L－OHP 細(xì)胞 Sox－2的表達(dá)顯著下降，而 miR－200c和let－7的表達(dá)顯著增加，說(shuō)明隨著耐藥性的下降，HT29/LOHP細(xì)胞的干細(xì)胞特性減弱。

綜上所述，本研究認(rèn)為CSC有可能是HT29細(xì)胞對(duì)L－OHP產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制之一。

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