林育紅 張麗麗▲ 劉彩剛

1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng) 110016；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，遼寧沈陽(yáng) 110001

肺癌是最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡率中位居前列。近年來(lái)，有包括手術(shù)、化療、放療等多種治療策略被廣泛應(yīng)用于臨床的肺癌治療中。然而，大于40%的患者在接受了抗腫瘤的綜合治療后出現(xiàn)了腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤復(fù)發(fā)患者中有相當(dāng)一部分出現(xiàn)了其他器官的轉(zhuǎn)移灶，并且預(yù)后不佳。因此，明確腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，在治療肺癌的過程中有著極為重要的意義。

近年來(lái)研究表明，腫瘤干細(xì)胞在細(xì)胞的惡變、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、腫瘤對(duì)放化療的抵抗中起著決定性的作用[1－2]。腫瘤干細(xì)胞有著自我更新和向其他多種類型腫瘤細(xì)胞分化的能力，并且有很高的致瘤性[3]。但是，至今尚不清楚干細(xì)胞相關(guān)的基因是否也在肺癌組織中表達(dá)，及這些基因是如何調(diào)控肺癌的發(fā)生和發(fā)展的。

Oct－4是一種轉(zhuǎn)錄蛋白，通常在干細(xì)胞中表達(dá)，是未分化的胚胎干細(xì)胞自我更新中的決定性調(diào)控因子[4－5]。筆者之前的研究表明，Nestin在肺癌中顯著表達(dá)。最近，筆者又發(fā)現(xiàn)在肺癌干細(xì)胞中Oct－4和Nestin的表達(dá)明顯高于其在其他腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平。但是，對(duì)于Oct－4和Nestin的表達(dá)與肺癌臨床特征之間的關(guān)系，以及Oct－4和Nestin在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)肺癌干細(xì)胞成瘤性的作用機(jī)制，幾乎是完全不明了的。

本實(shí)驗(yàn)在分析Oct－4和Nestin在肺癌干細(xì)胞成瘤作用中的角色基礎(chǔ)上，檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平。而后，又檢測(cè)了320例肺癌干細(xì)胞中Oct－4和Nestin的表達(dá)水平，并分析Oct－4和Nestin的表達(dá)與預(yù)后之間聯(lián)系的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2003年1月～2006年12月于沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院被確診為肺癌的患者320例，其中，年齡小于35歲者48例，54例為T1期，而有128例未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。將獲得的腫瘤組織樣本以免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。在此基礎(chǔ)之上，用PCR法分析其基因表達(dá)水平。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過手術(shù)治療的患者；②切除腫塊病理證實(shí)確為肺癌；③取出多于15個(gè)淋巴結(jié)送檢病理；④病例資料完整。排除接受過輔助療法的患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 集落形成實(shí)驗(yàn) 肺癌干細(xì)胞及非干細(xì)胞購(gòu)自沈陽(yáng)華鑫生物科技有限公司，其中，肺癌干細(xì)胞組作為實(shí)驗(yàn)組，而非干細(xì)胞組作為對(duì)照組。將細(xì)胞以2×104/mL密度培養(yǎng)于含有超短半橋粒（Corning，Acton，USA）的全 Mammo Cult培養(yǎng)基（STEM CELL Technologies，Vancouver，Canada）中 7 d。以盲法計(jì)數(shù)＜20 μm的細(xì)胞球數(shù)量。

1.2.2 PCR法使用TRIzol試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）從腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞中提取全RNA，根據(jù)廠家使用說明以RNA裂解小量洗脫凈化工具（Qiagen，Chatsworth，USA）提純。每次PCR分析的單個(gè)基因的循環(huán)閾值（Ct）都按照GADPH管家基因的平均Ct進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。不同細(xì)胞組間基因的表達(dá)差異由循環(huán)閾值的差值（ΔCt）決定。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中每個(gè)基因表達(dá)的折疊變化由2－ΔΔCt計(jì)算所得。差值＞2的單個(gè)基因被認(rèn)為是存在表達(dá)差異的。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法 用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中Oct－4和Nestin的表達(dá)水平。固定320例肺癌組織，并制成4 μm的組織切片，以二甲苯脫蠟，梯度酒精逐漸水化，再以磷酸緩沖液（PBS）沖洗，分別用1∶100濃度的鼠抗人Oct－4抗體和兔抗人Nestin抗體37°C孵育 1 h，PBS液洗滌后，以最佳生物素化的二抗（Multilink Swine anti－goat/mouse/rabbit immunoglobulin，Dako，Carpinteria，USA）在 37 °C中孵育30 min。用HRP抗生物素蛋白生物素復(fù)合物在室溫下 30～60 min（以 1∶1000 的濃度，Vector Laboratories，Burlingame，USA）檢測(cè)結(jié)合生物素基化的抗體。組織片段的免疫印跡以DAB做顯色處理，以吉爾蘇木素復(fù)染并觀察。來(lái)自于個(gè)體組織的3個(gè)片段全部以單抗體著色，依照盲法，每個(gè)片段隨機(jī)選擇10個(gè)結(jié)構(gòu)域通過病理檢測(cè)Oct－4和Nestin的表達(dá)。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)半定量檢測(cè)Oct－4和Nestin的表達(dá)水平，0：代表＜1%的贅生細(xì)胞印跡陽(yáng)性；1+：代表≥1%而＜10%的形態(tài)學(xué)上明確的贅生細(xì)胞印跡陽(yáng)性；2+：代表≥10%的形態(tài)學(xué)上明確的贅生細(xì)胞印跡陽(yáng)性。顯色1+或者2+的單個(gè)樣本認(rèn)為該蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，大量的連續(xù)數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)分析；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率分析；疾病特異性生存率以生存分析和時(shí)間等級(jí)檢驗(yàn)分析；個(gè)體因素的影響情況以COX比例機(jī)遇模型以向前階梯式選擇的方式進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)情況

取腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞在體外培養(yǎng)7 d，檢測(cè)細(xì)胞的成球情況。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞能夠形成20～100 μm的細(xì)胞球，并且可以在體外試驗(yàn)中繼續(xù)傳代（圖1A－B），而非腫瘤干細(xì)胞則不能（圖1C－D）。

2.2 肺癌中Oct-4和Nestin的表達(dá)

在肺癌干細(xì)胞和非肺癌干細(xì)胞之間，用PCR法檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的差異性。本研究發(fā)現(xiàn)，CD44、Oct－4、Nestin、APC、CDC2、HGF和 TGF基因在肺癌干細(xì)胞和非肺癌干細(xì)胞中均有顯著的表達(dá)差異，其中，Oct－4和Nestin通常由干細(xì)胞表達(dá)。為了顯示Oct－4和Nestin的表達(dá)特征，本研究采用320例肺癌樣本以免疫組化法分析Oct－4和Nestin的表達(dá)水平（表1）。研究發(fā)現(xiàn)，128例（40.00%）的肺癌組織中抗Oct－4陽(yáng)性，而62例（19.38%）的肺癌組織中抗Nestin陽(yáng)性。值得注意的是，有42例（13.13%）癌癥組織中抗 Oct－4 和抗 Nestin 同時(shí)陽(yáng)性（圖2）。 分析顯示，Oct－4和Nestin的共表達(dá)與年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P ＜ 0.05）。多元統(tǒng)計(jì)分析提示，在肺癌人群中，Oct－4和Nestin的共表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移獨(dú)立相關(guān)（P＜0.05）。 見表2。

表1 患者一般臨床資料（例）

2.3 Oct-4和Nestin的共表達(dá)與肺癌預(yù)后不良相關(guān)

在所有320例樣本中，303例患者生存期超過7.5年，占94.67%。生存分析顯示，有Oct－4陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者比Oct－4陰性表達(dá)患者有較低的生存率（71.09%比91.67%，χ2=29.04，P=0.001，圖3A）。相似的是，有 Nestin 陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者也比Nestin陰性表達(dá)的患者有較低的生存率（64.52%比 87.98%，χ2=30.71，P=0.001，圖3B）。此外，Oct－4和Nestin共表達(dá)與預(yù)后不良有著明顯的相關(guān)性（57.14%比 87.41%，χ2=48.49，P=0.001，圖3 C、表3）。 值得注意的是，15例中有13例年齡＜35歲的Oct－4和Nestin表達(dá)陽(yáng)性患者在術(shù)后5年內(nèi)死亡。

表2 Oct-4和Nestin共表達(dá)的多元統(tǒng)計(jì)分析

表3 肺癌預(yù)后因子的多因素回歸分析

3 討論

研究已經(jīng)證明，從實(shí)體瘤中分離得到的腫瘤干細(xì)胞有著高度的自我更新和分化成不同表現(xiàn)型的腫瘤細(xì)胞的能力。研究中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤干細(xì)胞中有Oct－4和Nestin表達(dá)。此外，腫瘤干細(xì)胞，尤其是有Oct－4和Nestin高水平表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞有成球能力，但是非腫瘤干細(xì)胞在同樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件下沒有成球能力。這些異常的數(shù)據(jù)明確提示，腫瘤干細(xì)胞有著干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并且在肺癌的發(fā)展中起著決定性的作用[6－7]。

很多基因在腫瘤干細(xì)胞中高度表達(dá)，并在維持腫瘤干細(xì)胞生物功能方面起著重要作用，例如Oct－4、Nestin、HGF、APC、CD44等。本研究以PCR方法總結(jié)了干細(xì)胞相關(guān)基因的差異表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)包括CD44、Oct－4、Nestin、APC、CDC2、HGF和TGF等基因在內(nèi)的很多基因都在腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞中差異表達(dá)，而Oct－4和Nestin在很多腫瘤干細(xì)胞中呈共表達(dá)。Oct－4是一種重要的能夠調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新能力和多潛能性的轉(zhuǎn)錄因子，盡管Oct－4被發(fā)現(xiàn)在一些成體的已分化細(xì)胞中表達(dá)[8]，但是它仍被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的一種生物學(xué)標(biāo)記。Nestin是一種中間絲蛋白，它表達(dá)于神經(jīng)元和正在成長(zhǎng)的細(xì)胞中。Nestin還在濾泡干細(xì)胞中表達(dá)，并且起著調(diào)節(jié)細(xì)胞重塑、增生和分化、增殖的功能[9]。

筆者近來(lái)的研究提示，Nestin也許會(huì)是一個(gè)新的可能的肺癌腫瘤標(biāo)志物。本文深入的研究了320例肺癌樣本中Oct－4和 Nestin的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在其中42例樣本中Oct－4和Nestin共表達(dá)。尤為驚人的是，通用多元分析顯示，Oct－4和Nestin的共表達(dá)與起病年齡較小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。COX回歸分析提示，Oct－4和Nestin的共表達(dá)與肺癌預(yù)后不良亦有相關(guān)性。

綜上所述，本研究顯示，Oct－4和Nestin在肺癌干細(xì)胞中顯著表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和肺癌患者較短的生存期相關(guān)。提示Oct－4和Nestin也許在調(diào)節(jié)肺癌發(fā)展過程中起到了重要的作用。

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