鄧 燕

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的一種常見全身性微血管病變并發(fā)癥，是終末期腎功能衰竭(ESRD)的重要原因之一。DN的病因主要涉及遺傳因素、腎臟血流動力學(xué)改變、糖代謝異常、細胞因子等因素，其發(fā)病機制復(fù)雜。其中，高血糖是引起糖尿病腎功能衰竭的最主要因素［1-2］。腎小球系膜細胞(GMC)是腎臟最易被激活的細胞，可被多種免疫反應(yīng)產(chǎn)物、炎癥因子以及非免疫產(chǎn)物激活。因此，當DN患者腎臟發(fā)生損壞時，高血糖過度累積，導(dǎo)致腎臟腎小球受損，產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)產(chǎn)物、炎癥因子及非免疫產(chǎn)物，激活GMC;GMC同時釋放多種炎癥介質(zhì)，細胞外基質(zhì)大量聚集，進一步損害腎小球;如此惡性循環(huán)，導(dǎo)致腎小球硬化［3-4］甚至腎功能衰竭。有研究表明，普伐他汀聯(lián)合二甲雙胍治療2型糖尿病合并高脂血癥能明顯改善血糖血脂異常，效果良好，且無嚴重不良反應(yīng)發(fā)生［5］。本文觀察2種藥物聯(lián)用對GMC增殖的影響，為臨床治療DN提供藥理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腎小球系膜細胞(武漢博士德生物有限公司，批號:HBZY-1)。藥品:普伐他汀片(上海三共制藥有限公司，規(guī)格:20 mg×7片，批號:110615-12);鹽酸二甲雙胍緩釋片(中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格:0.5 g×20片，批號:110823-02)。試劑:D-Hanks溶液及1640營養(yǎng)液(上海研拓生物);胰蛋白酶(1∶250)(武漢禾元生物);胎牛血清(上海勁馬生物);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(廣州市鼎盈貿(mào)易有限公司);二甲基亞楓(DMSO)及噻唑蘭(MTT)(西寶生物)。儀器:CO2培養(yǎng)箱(長沙長錦科技有限公司);微量加樣器、超凈工作臺、電子天平(精準度為0.01 g)、離心機，上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司;Multiskan FC酶標儀(美瑞泰克科技);96孔板細胞培養(yǎng)板(上海研拓生物)。RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute，RPMI，洛斯維公園紀念研究所研發(fā)的一類培養(yǎng)基)培養(yǎng)液的配制:取1袋1640粉劑，溶于雙蒸水中，稱取2 g NaHCO3粉末、2.38 g谷氨酰胺，加入上述1640溶液中，加雙蒸水至1 000 mL，再用濃度均為0.1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9，濾菌器過濾后分裝置于-20℃保存?zhèn)溆?。EDTA-胰蛋白酶溶液的配制:分別稱取0.25 g胰蛋白酶粉末、0.04 g EDTA溶于100 mL D-Hank'S液，攪拌混勻，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌，即得0.04%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液，用小青霉素瓶分裝保存于-20℃恒溫箱備用。

1.2 方法

1.2.1 GMC的傳代培養(yǎng)［6］GMC購回即棄去培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，第2天開始取細胞株進行傳代培養(yǎng):吸掉培養(yǎng)液，加1～2 mL EDTA-胰酶消化液，輕搖培養(yǎng)瓶，使所有細胞表面均有消化液。輕輕吹打細胞，吸出消化液和細胞，加入15 mL離心管內(nèi)，2 000 r/min離心10 min，吸出上清液，加入培養(yǎng)液;再次以2 000 r/min離心10 min，吸出上清液;加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。分裝2個25 cm2培養(yǎng)瓶，置入飽和濕度、37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3天換1次液并進行傳代，共傳3～4代。取第4代GMC進行下游操作。

1.2.2 高糖刺激GMC增殖 根據(jù)文獻報道［7-8］，葡萄糖濃度為0.6 g/L時刺激作用最明顯。本試驗取上述第4代的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，約含3×104個細胞，細胞貼壁后，使細胞生長同步于對數(shù)生長期，保持細胞間具有可比性。設(shè) 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 5 個葡萄糖組，另設(shè)空白組，每組16孔?？瞻捉M加入蒸餾水20 μL，各試驗組加入對應(yīng)濃度葡萄糖20 μL。培養(yǎng)板置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，各組分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h，終止前 4 h 每孔加入0.5%MTT溶液。培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加100 μL DMSO中止培養(yǎng)，輕微震蕩10 min使結(jié)晶溶解，用酶標儀在波長490 nm下檢測吸光度值。

1.2.3 普伐他汀聯(lián)合二甲雙胍對高糖刺激GMC增殖的影響 采用“1.2.2”項下的方法，在葡萄糖0.6 g/L 20 μL刺激結(jié)束后，設(shè)5組:空白組為未經(jīng)葡萄糖處理的細胞，加入20 μL蒸餾水;高糖組加入20 μL蒸餾水;大劑量組加入5.3 mg/L普伐他汀和400 mg/L二甲雙胍各10 μL;中劑量組加入2.7 mg/L普伐他汀和200 mg/L二甲雙胍各10 μL;小劑量組加入 1.3 mg/L普伐他汀和100 mg/L各10 μL。每組18個孔，同步進行，各組在24、48、72 h后分別取出20 μL 加入 0.5%MTT溶液，后續(xù)操作同“1.2.2”項。高糖組及藥物組在藥物干預(yù)期間均未再加糖處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖不同時間點對GMC增殖的影響 在相同培養(yǎng)條件下，空白組細胞在不同時間點細胞生長明顯比葡萄糖各組慢(P＜0.05);0.6 g/L組對GMC增殖的刺激作用明顯比其他劑量組強(P＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度葡萄糖不同時間點對GMC增殖的影響

2.2 普伐他汀聯(lián)合二甲雙胍對高糖刺激的大鼠GMC增殖的影響 在相同培養(yǎng)條件下，高糖組細胞生長速度明顯高于空白組(P＜0.05)，表明葡萄糖誘導(dǎo)大鼠GMC細胞增殖模型成功;普伐他汀聯(lián)合二甲雙胍不同劑量組細胞在48、72 h生長速度較高糖組明顯減緩(P＜0.05);大劑量組與中劑量組48、72 h生長速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);大劑量組與小劑量24 h生長速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而72 h生長速度較小劑量組明顯減緩(P＜0.05)，見表2。

表2 普伐他汀聯(lián)合二甲雙胍不同濃度在不同時間點對高糖刺激大鼠GMC的影響

3 討論

GMC是腎臟血管周圍反應(yīng)活躍的腎小球細胞，具有多種功能，可產(chǎn)生細胞外基質(zhì)和細胞因子，且可通過吞噬、處理免疫復(fù)合物，清除大分子蛋白，保持腎小球濾過膜的通透性。當腎小球受局部因素和體循環(huán)而來的介質(zhì)損傷時，GMC首先受損害［9-10］，因此，GMC是腎小球腎炎病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。正常情況下GMC不發(fā)生明顯增殖，但在高糖等因素作用下，可見GMC及細胞外基質(zhì)同時發(fā)生異常增生，導(dǎo)致腎組織纖維化和硬化。DN以腎臟硬化性病變?yōu)橹?，病理可見毛細血管基底膜增厚，系膜區(qū)擴張、基質(zhì)增多。DN早期，GMC在高糖環(huán)境下可代償性調(diào)控葡萄糖的異常代謝，出現(xiàn)細胞肥大，但數(shù)目增加不顯著。因此，若能有效控制GMC異常增生，對延緩腎臟纖維化、腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展有重要意義［11］。有報道，高濃度葡萄糖可以促進GMC迅速增殖［12］。本研究通過觀察不同濃度葡萄糖對GMC增殖的影響，發(fā)現(xiàn)0.6 g/L濃度最佳。然后在同樣孵育環(huán)境下，以濃度為0.6 g/L的葡萄糖誘導(dǎo)GMC增殖，并觀察普伐他汀聯(lián)用二甲雙胍不同劑量對GMC增殖的影響。在兩藥聯(lián)合作用下，高糖誘導(dǎo)的GMC在約24 h時增殖放緩，并于48、72 h時增殖速度明顯下降，在72 h后高劑量組的GMC增殖速度最慢(與中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義)，但與小劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示該劑量對GMC增殖的抑制作用最強。因此，筆者認為普伐他汀與二甲雙胍聯(lián)用具有抑制高糖刺激的大鼠GMC增殖的作用，為臨床治療DN提供了實驗依據(jù)，但其作用機制尚待后續(xù)研究。

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