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        小鼠耐藥蛋白的測定及耐藥癲疒間所致腦損傷的研究

        2013-10-16 03:15:42陳淑良劉向陽
        實用藥物與臨床 2013年10期
        關鍵詞:苯妥英鈉糖蛋白免疫組化

        張 策,陳淑良,劉向陽

        癲疒間在經過正規(guī)服用抗癲疒間藥物治療后,雖然能夠達到正常的血藥濃度,但其中仍有約30%的患者不能達到有效控制[1],進而進展成為難治性對于這種難治性癲疒間的產生機制尚存在爭議,現(xiàn)基本考慮為多種機制共同作用的結果,在對癲疒間患者腦部不同部位的切片進行分析的過程中發(fā)現(xiàn),癲疒間患者腦內神經細胞缺失,星型膠質細胞高度表達,膠質纖維酸蛋白高度表達,神經細胞的神經核、胞體、樹突等均有明顯的病理改變[2]。其中,P-糖蛋白等多種耐藥蛋白的高度表達是目前學術界比較公認的產生癲疒間耐藥的一個機制[3-5],作為這種耐藥性的深入研究,耐藥癲疒間模型的制作具有基礎性意義。本研究采用小鼠制作耐藥癲疒間模型,同時考察耐藥癲疒間小鼠腦內P-糖蛋白的表達情況及腦組織的損傷情況,為耐藥模型逆轉的進一步研究奠定理論基礎。

        1 實驗材料與方法

        1.1 實驗動物 成年雄性昆明種小鼠(18~25 g),由大連醫(yī)科大學SPF實驗動物中心提供,實驗期間小鼠生活在20~24℃環(huán)境下,環(huán)境濕度50% ~65%,自然晝夜節(jié)律。給予正常鼠糧和飲用水。

        1.2 癲疒間模型的建立 取10只小鼠,每日給予低于痙攣劑量的致癇藥物戊四氮,40 mg/kg,每日12點腹腔注射,連續(xù)注射7 d。每次注射后觀察小鼠癲疒間情況0.5 h,記錄小鼠癲疒間發(fā)作級別和持續(xù)時間,小鼠癲疒間發(fā)作級別按racine分級定義如下[6]:0級:無明顯反應;1級:面部自主性運動(如舔吃,咀嚼);2級:點頭、甩頭、眨眼、面部痙攣;3級:2級+單側或交替性雙側前肢痙攣;4級:2級+后退、雙側前肢痙攣;5級:4級+動物跌倒、尾巴上翹,耳朵縮卷。產生“5次連續(xù)的2級癲疒間或3次連續(xù)的4 級以上癲疒間”確認癲疒間點燃成功[7]。

        1.3 耐藥模型的建立[8]將癲疒間模型制作成功的小鼠給予低劑量苯妥英鈉40 mg/kg,1次/d灌胃給藥,連續(xù)給藥14 d,給藥后考察癲疒間小鼠的癲疒間發(fā)作情況,將給藥后仍有癲疒間發(fā)作并符合“產生5次連續(xù)的2級癲疒間或3次連續(xù)的4級以上癲疒間”的小鼠確定為耐藥癲疒間小鼠。另取20只小鼠按隨機數(shù)字表隨機分為2組,陰性對照組給予生理鹽水,耐藥癲疒間模型組制作耐藥癲疒間模型,最后取制作耐藥癲疒間模型成功的小鼠與陰性對照組一起進行P-糖蛋白的表達及組織化學研究。

        1.4 小鼠腦內P-糖蛋白的測定 各組最后一次給藥0.5 h后處死小鼠,快速取全腦。按腦組織重量(1 mg∶1 mL)加裂解液,勻漿。置冷凍離心機,13 000 r/min、4℃離心10 min。加1 mL上樣緩沖液,10 μL 上樣,聚丙烯酰胺凝膠膜,30 mA,1.5 h。9 V恒壓轉膜40 min,1×麗春紅染液染25 min,4℃封閉過夜,將轉移膜置于用PBS稀釋200倍的一抗(鼠 C219 P-糖蛋白單克隆抗體Signet Labratories,USA),37 ℃水浴過夜,用 TTBS室溫下脫色搖床洗10 min,共2次,再用TBS洗10 min。將轉移膜與以PBS稀釋12 000倍的二抗(C219第二抗體 Pakolytomatics,glostrup,Denmark)接觸,37℃水浴1.5 h。用 TTBS室溫洗10 min,共2次,再用TBS洗10 min,進行DAB顯色反應,避光放置5~10 min,出現(xiàn)條帶后終止反應,將膜片進行凝膠圖像分析。

        1.5 免疫組化法考察小鼠大腦損傷情況 各組小鼠腦組織標本采用10%甲醛固定,石蠟包埋后切片脫蠟至水,用0.01 M PBS洗5 min,共洗3次,置于3%H2O2室溫下 15 min,再用 0.01 M PBS洗5 min,共洗3次,用動物羊血清室溫孵育15 min,傾去,勿洗。加Caspase-3兔抗鼠一抗(工作濃度1∶50)4℃過夜18 h,室溫下穩(wěn)定30 min后用0.01 M PBS洗3次,每次洗5 min。加入生物素化羊抗兔二抗37℃孵育20 min,0.01 M PBS洗3次,每次5 min。DAB顯色2 min,用流水沖洗10 min,蘇木素復染 10 s,流水返藍10 min,脫水、透明封片,鏡下觀察。

        1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件,計量資料采用±s表示,采用兩獨立樣本的t檢驗考察兩組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 耐藥癲疒間模型的建立 戊四氮制作癲疒間模型7 d后,所有小鼠均由少癲疒間發(fā)作逐漸到5級發(fā)作,發(fā)作情況也趨于穩(wěn)定。造模成功后,小鼠均表現(xiàn)了對聲音敏感。在給予戊四氮第8天,給予低劑量苯妥英鈉1次/d灌胃給藥,連續(xù)應用14 d,將符合“產生5次連續(xù)的2級癲疒間或3次連續(xù)4級以上癲疒間”確定為耐藥癲疒間模型,見圖1。在本次試驗中,10只小鼠中有2只小鼠沒有耐藥,耐藥率為80%。

        圖1 戊四氮誘導苯妥英鈉治療的耐藥癲疒間模型的建立(n=10)

        2.2 P-糖蛋白在腦中的表達 小鼠造模成功后斷頭取腦,用Western blot方法考察腦內P-糖蛋白的表達情況,見圖2。

        圖2 兩組比較的Western blot蛋白條帶

        從小鼠P-糖蛋白的全腦表達來看,耐藥癲疒間模型組較空白組小鼠腦內P-糖蛋白的表達顯著增高(P<0.01),Gel-Pro analyzer灰度分析軟件對條帶進行分析,P-糖蛋白表達的光密度值的平均值及95%可信區(qū)間用柱形圖表示。見圖3。

        圖3 耐藥癲疒間模型組小鼠腦內P-糖蛋白的表達情況

        2.3 耐藥癲疒間對小鼠腦組織的損傷 小鼠造模成功后處死取腦,HE染色結果顯示無論是在海馬區(qū)還是皮層區(qū),耐藥模型組與陰性對照組相比,小鼠腦內神經元排列凌亂,核膜不完整,核仁染固縮,變形(P<0.05),見圖4。

        圖4 小鼠腦海馬和皮層HE染色結果

        免疫組化Caspase-3實驗顯示無論是在皮層還是在海馬區(qū),與陰性對照組相比,耐藥癲疒間模型組呈現(xiàn)Caspase-3的表達(P<0.05)。見圖5。

        圖5 小鼠腦組織Caspase-3免疫組化結果

        3 討論

        依據(jù)本文的方法能夠建立比較穩(wěn)定的耐藥癲疒間模型,通過對篩選出的耐藥癲疒間模型的相關研究發(fā)現(xiàn),耐藥癲疒間腦呈現(xiàn)P-糖蛋白的高度表達,支持P-糖蛋白高表達與癲疒間耐藥伴隨發(fā)生的觀點,如果發(fā)現(xiàn)一種藥物能夠顯著抑制這種P-糖蛋白的表達,將對臨床具有實際意義。耐藥癲疒間小鼠腦組織的免疫組化顯示,耐藥性癲疒間引起了小鼠大腦組織的損傷,造成大量的神經元壞死,這種壞死可能形成一個新的神經電傳導通路[9],降低了癲疒間發(fā)作的閾值,使癲疒間患者的癲疒間更加不能控制。在免疫組化的研究中發(fā)現(xiàn),采用Caspase-3的表達間接考察小鼠用藥后腦細胞神經元的凋亡情況,得出耐藥癲疒間的發(fā)生伴隨著大量神經細胞的凋亡,可能參與了耐藥性的產生。

        [1]馬愛梅,陳英輝,胡風云.MK-801對耐苯妥英鈉和卡馬西平癲疒間大鼠模型腦表達 P-糖蛋白的影響[J].中華神經科雜志,2010,43(6):444-446.

        [2]Chengyun D,Guoming L,Elia M,et al.Expression of multidrug resistance type 1 gene(MDR1)P-glycoprotein in intractable epilepsy with different aetiologies:a double-labelling and electron microscopy study[J].Neurol Sci,2006,27:245-251.

        [3]Volk HA,Burkhardt K,Potschka H,et al.Neuronal expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in the rat hippocampus after limbic seizures[J].Neuroscience,2004,123:751-759.

        [4]Volk HA,Potschka H,Loscher W,et al.Increase expression of the multidrug transporter P-glycoprotein in limbic brain regions after amygdala-kindled seizures[J].Epilepsy research,2004,58:67-79.

        [5]Volk HA,Potschka H,Loscher W,et al.Immunohistochemical localization of P-glycoprotein in rat brain and detection of its increased expression by seizure are sensitive to fixation and staining variables[J].Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2005,34:517-531.

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