張麗平

(太原科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，太原 030024)

稀土是鑭系及鈧、釔共17種元素的總稱。隨著稀土元素在工農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，有關(guān)其在生物體內(nèi)的代謝、積累及生物學(xué)效應(yīng)的研究已成為熱點[1]。由于稀土元素的化合物具有多種生物學(xué)以及藥物活性[2-4]，所以其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究很早就引起了廣泛關(guān)注[5]。目前臨床上釓的配合物被用于磁共振成像的造影劑，以及碳酸鑭治療晚期腎衰所引發(fā)的高磷酸血癥[6]等。很多的研究表明稀土及其化合物在藥理方面有多的潛在應(yīng)用價值[7]。同時，稀土化合物對生物體的負面效應(yīng)也一直受到廣泛的關(guān)注。

稀土鑭是鑭系元素中的第一個元素，因為La3+在離子半徑、配位能力及與含氧配體親和力等方面與Ca2+很相似，因此，當鑭離子進入生物體后可能占據(jù)或取代很多蛋白(如:離子通道蛋白、G蛋白以及鈣調(diào)蛋白等)中鈣的位點[8-9]，從而影響細胞的功能。與此同時，有關(guān)鑭離子對細胞增殖和凋亡的研究也很多[10-13]。本文研究了稀土鑭對成纖維NIH3T3細胞增殖，周期和凋亡的影響，為進一步明確稀土鑭的細胞生物學(xué)效應(yīng)提供一些實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

FACS流式細胞儀(美國 Becton-Dickinson公司);水套式CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。成纖維NIH3T3細胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院提供;胰蛋白酶和DMEM細胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;溴化二甲噻唑二苯四氮唑—噻唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)和RNase酶購自美國Sigma公司;胎牛血清購自杭州市四季青生物工程材料研究所。其余試劑都是國產(chǎn)的(分析純)。

三氧化二鑭為湖南省稀土研究所產(chǎn)品。鑭離子溶液的制備:將濃鹽酸加入三氧化二鑭中，加熱溶解到鹽酸揮發(fā)將干為止，隨后加入純凈水溶解定容，配制成20毫摩爾每升儲備液，在0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 成纖維細胞的培養(yǎng)和傳代

在37℃、5%CO2和飽和濕度的條件下，加入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細胞。在成纖維細胞生長到接近單層時，通過含0.25%胰酶的消化液消化后，按1∶3比例進行傳代培養(yǎng)，每2 d～3 d換1次培養(yǎng)液，然后置于顯微鏡下，細心觀察細胞的貼壁形態(tài)和生長狀況。傳代幾次后，等到細胞的生長狀態(tài)良好時，再進行其他實驗。

1.3 成纖維NIH3T3細胞的活性檢測

將處在生長旺盛期的成纖維細胞消化后，用培養(yǎng)液制成單個細胞懸浮液，并使細胞濃度大概為2×104個/ml，再接種到96孔板中，每孔加入細胞液200 μL，細胞數(shù)大概為 4×103個/孔，每組設(shè)6個平行孔，并且重復(fù)3次。培養(yǎng)24 h后，仔細棄去清液，加入新的細胞培養(yǎng)液，同時加入鑭離子溶液，使其最終濃度分別為 1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L.繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，然后每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，仔細棄去清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，并在震蕩器上振蕩10 min，將結(jié)晶物溶解完全后，測定490 nm波長下各孔的吸光度(A)值，按照下面公式計算細胞活力:

細胞活力(%)=(加藥組A值平均數(shù)/對照組A值平均數(shù))×100%.

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數(shù)生長期的細胞消化后，接種于25 ml的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，仔細棄去清液，加入新的細胞培養(yǎng)液，同時加入鑭離子溶液，使其終濃度分別為 1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L.繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，用PBS洗3次，消化后加入培養(yǎng)液制成單細胞懸浮液，以1000 rpm離心5 min，仔細棄去清液，再用冷的PBS洗3次，加入預(yù)冷的75%乙醇固定細胞，4℃過夜。染色前用PBS洗滌離心2次，除去固定液，加入200 μl的10 mg/L RNase消化，37 ℃水浴30 min，再加入600 μl的50 mg/L的PI染色液混勻，4℃避光染色30 min，用400目篩網(wǎng)過濾后，上機檢測。

1.5 細胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期的細胞消化后，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，仔細棄去清液，加入新的培養(yǎng)液，同時加入鑭離子溶液，使其最終濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1000 μmol/L.繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，用PBS洗3次，消化后加入培養(yǎng)液制成單細胞懸浮液，以1000 rpm離心5 min后，棄去上清液，再用冷 PBS洗3次，接著用Annexin V/PI凋亡試劑盒進行雙染色，避光室溫反應(yīng)20 min，加入300 μl緩沖液，立即用流式細胞儀進行檢測。

2 實驗結(jié)果

2.1 LaCl3促進NIH3T3細胞增殖

不同濃度 LaCl3(0，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L)分別作用NIH3T3細胞不同時間后，MTT法分析結(jié)果(圖1)表明:LaCl3可明顯促進NIH3T3細胞的增殖，并且具有一定的時間和濃度依賴性。100 μM LaCl3作用72 h后細胞增殖率可達到46.7%.

分別加入不同濃度 LaCl3(0，1 μmol/L，10 μmol/L，

圖1 La促進NIH3T3細胞增殖Fig.1 La promoted cell proliferation of NIH3T3 cells

2.2 LaCl3加快G1/S細胞周期進程

圖2 La對NIH3T3細胞周期的影響Fig.2 Effect of La on the cell cycle of NIH3T3 cells

50 μmol/L，100 μmol/L)作用NIH3T3 細胞72 h 后，流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果顯示(圖2)，與對照組相比，LaCl3使G1期細胞數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，S期細胞數(shù)明顯上升(P＜0.01)。結(jié)果提示LaCl3可能通過加快G1/S期轉(zhuǎn)換而促進NIH3T3細胞增殖。

2.3 LaCl3未引起NIH3T3細胞凋亡

不同濃度 LaCl3(0，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L，1000 μmol/L)作用 NIH3T3 細胞72 h 后，流式細胞分析儀結(jié)果表明:所選濃度條件下，LaCl3基本上不引起NIH3T3細胞的凋亡。

3 結(jié)論

研究已發(fā)現(xiàn)，鈣元素參與廣泛的生理過程，如細胞興奮性的控制、細胞代謝的調(diào)節(jié)、細胞形態(tài)的維持以及細胞周期的調(diào)控等。本文研究了不同濃度的LaCl3作用NIH3T3細胞后可促進其增殖，使G1期細胞數(shù)量明顯減少，S期細胞數(shù)明顯上升。此表明LaCl3可促進成纖維NIH3T3細胞的G1/S期轉(zhuǎn)換，加快細胞周期進程，從而提高其增殖活性。稀土元素鑭促進成纖維NIH3T3細胞的增殖的可能機制為:由于La3+與Ca2+具有很多的相似性，所以La3+進入細胞內(nèi)后可能占據(jù)或取代很多蛋白包括離子通道蛋白、G蛋白和鈣調(diào)蛋白等中鈣的位點，從而影響細胞的一系列生物功能，進而促進細胞的增殖。此機制還有待于進一步的深入研究。

La3+對細胞增殖和凋亡的影響廣被研究。王熙等[14]研究表明 La3+促進成骨細胞的增殖和分化，而劉絲蓀等[15]研究表明氯化鑭抑制宮頸癌Hela細胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡，氯化鑭還可抑制大鼠肝癌細胞株CBRH-7919細胞的生長[16]。這些研究表明:在不同條件和對象下，稀土元素的生物效應(yīng)不完全相同。因此，只有在全方位的系統(tǒng)研究下，才能更全面、更準確的了解稀土元素的生物效應(yīng)，才會有助于我們更準確地把握稀土元素生物效應(yīng)的內(nèi)在機制和應(yīng)用價值。

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