徐文華，韓寶芹，孔曉穎，劉萬順

＊＊

（1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266021）

腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）簡稱為腎癌，是起源于腎實質(zhì)層泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎惡性腫瘤的80%～90%，是泌尿系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，幾乎占成人惡性腫瘤發(fā)病率的2%～3%［1－2］。全球每年死于腎癌的人數(shù)約有100 000人次。大約1／3的腎癌患者在初次就診時就已發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移［3］，即使局限性腎癌患者行根治性手術(shù)后，仍有大約20%～30%的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率［4］。腎癌對傳統(tǒng)的放化療均不敏感。

殼寡糖是由3～10個氨基葡萄糖或N－乙酰氨基葡萄糖經(jīng)β－1，4糖苷鍵連接而成的線性寡聚體［5－6］。殼寡糖能很好地經(jīng)腸道被人體吸收［7］，展現(xiàn)出優(yōu)越的生物學(xué)特性，具有調(diào)節(jié)血脂、血糖和血壓，吸附膽固醇和強(qiáng)化肝臟功能等。殼寡糖對部分腫瘤有抑制作用［8－9］，但其對腎癌的作用卻鮮有報道。本文旨在探討其對腎癌細(xì)胞OS－RC－2的作用及作用機(jī)制，從而為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞和實驗動物 OS－RC－2人腎癌細(xì)胞購于購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。裸鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量約（20±3）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 主要試劑 COS（相對分子質(zhì)量為1 000）由青島博益特生物有限公司提供。新生牛血清由美國GIBCO公司提供。PR－PCR試劑盒由Promega公司提供。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Hyclone公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT）和吖啶橙－溴乙錠（AO－EB）購自Sigma公司。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）引物由上海生物工程有限公司合成，抗體由北京中山制劑公司提供。其他試劑均為分析純級。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；Nikon Eclipse Ti－E全自動倒置顯微鏡購自日本尼康公司；Rayto2100C酶標(biāo)儀購自美國雷杜公司；FACSCalibur TM BD型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；Enppendorf 5415D離心機(jī)購自德國艾本德股份公司；9700型PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司；DYCP－44P凝膠電泳儀購自北京六一公司；H－500透射電鏡購自日本日立公司。

1.2 體外實驗方法

1.2.1 OS－RC－2腎癌細(xì)胞的體外培養(yǎng) 腎癌細(xì)胞OS－RC－2在含有體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，4d傳代，用含0.2g／L EDTA 的2.5 g／L胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞回縮變圓時，加入新鮮培養(yǎng)液終止消化，離心，棄上清，用新鮮培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至109／L進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用胎盤藍(lán)拒染法觀察細(xì)胞存活率（存活率在95%以上后進(jìn)行以下實驗）。

1.2.2 COS對OS－RC－2腎癌細(xì)胞增殖的影響 消化OS－RC－2腎癌細(xì)胞并調(diào)細(xì)胞密度為5×104／L，96孔板每孔接種200μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。實驗組分別加入500、300、100、50mg／L的 COS（含體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制）各200μL，對照組加入200μL含體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2、4d觀察細(xì)胞狀態(tài)，每孔加入5g／L的 MTT20μL，37℃孵育4h。加入二甲基亞砜150μL，37℃保溫10min，用酶標(biāo)儀（490nm波長處）測各孔的A值。

1.2.3 COS對 OS－RC－2腎癌細(xì)胞凋亡的影響 96孔板中接種細(xì)胞，方法同1.2.2。在細(xì)胞培養(yǎng)3d時，向200μL細(xì)胞懸液中加入8μL AO－EB染色液，并用熒光顯微鏡對細(xì)胞拍照。每組分別計數(shù)200個細(xì)胞并觀察細(xì)胞形態(tài)。活細(xì)胞（VN）為綠色且含有正常染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞（VA）為綠色但含有固縮狀染色質(zhì)的細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞（NVA）為橙色且含有固縮狀染色質(zhì)的細(xì)胞，壞死細(xì)胞（NVN）為橙色但含有正常染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的已死但未凋亡的細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡率＝（NVN＋NVA）／（VN＋VA＋NVN＋NVA）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀觀察COS用藥前后細(xì)胞周期的變化

消化收集OS－RC－2并調(diào)細(xì)胞密度為5×107／L，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶3mL，常規(guī)培養(yǎng)24h后，對照組加入含體積分?jǐn)?shù)0.10和0.005胎牛血清的培養(yǎng)基，實驗組同時加入不同濃度的COS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，離心得細(xì)胞沉淀，100μL PBS重懸，置體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇中4℃固定2h，然后用100μL PBS重懸，加入Rnase 100μL和25mg／L的PI單染溶液200μL，4℃避光30min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 體內(nèi)實驗方法

1.3.1 小鼠OS－RC－2腎癌腫瘤模型的建立和實驗培養(yǎng)腎癌細(xì)胞OS－RC－2，制成1mL細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為107／L），注入2只小鼠腹腔。待腹水后，抽出腹水稀釋1倍，再次注入健康小鼠腹腔進(jìn)行傳代一次。再抽取腹水離心，生理鹽水洗后于小鼠右前肢腋窩皮下接種（109／L，每只0.2mL）。小鼠接種24h后，隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組（環(huán)磷酰胺）和COS各用藥組，每組6只小鼠。COS各組分別用50、100、300、500mg／kg COS灌胃，陽性對照組灌胃環(huán)磷酰胺（300mg／kg），模型對照組灌胃生理鹽水，連續(xù)給藥15d［10］。

1.3.2 腫瘤抑制率測定 給藥15d后，次日剝離瘤塊，稱其重量并計算抑瘤率。

腫瘤抑制率（%）＝（模型對照組的瘤質(zhì)量－治療組的瘤質(zhì)量）／模型對照組瘤質(zhì)量×100%。

1.3.3 RT－PCR檢測VEGF基因的表達(dá) 每組取瘤組織50mg，用Trizol提取總RNA。取1μg總RNA進(jìn)行PT－PCR擴(kuò)增實驗。VEGF引物序列：上游5′－CCTTGCTGCTCTACCTCC－3′，下游5′－AAATGCTTT CTCCGCTCT－3′；（擴(kuò)增產(chǎn)物500bp）內(nèi)參照（GADPH）引物序列：上 游 5′－ACTGCCACCCAGAAGACT－3′，下 游 5′－GCTCAGTGTAGCCCAGGAT－3′。嚴(yán)格按照試劑盒方法進(jìn)行操作。反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃變性30 s，53℃退火1min，72℃延伸1min，30次循環(huán)后，72℃再延伸5min。電泳產(chǎn)物在15g／L瓊脂糖凝膠上電泳，用Quantity－one對條帶進(jìn)行吸光度掃描，檢測各組mRNA產(chǎn)物A值，以AVEGF／AGADPH表示其相對表達(dá)水平。

1.3.4 VEGF免疫組化檢測 瘤組織經(jīng)石蠟包埋切片、抗原修復(fù)，浸入體積分?jǐn)?shù)0.003過氧化氫溶液，滴加一抗工作液（兔抗鼠VEGF抗體，1：250），4℃冰箱過夜后，滴加相應(yīng)二抗工作液，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察結(jié)果。

1.3.5 透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡 將腫瘤切塊（1.5mm×2.0mm），迅速經(jīng)40g／L戊二醛前固定，清洗后用10g／L鋨酸后固定，常規(guī)脫水、浸透、環(huán)氧樹脂包埋、醋酸雙氧鈾－枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以mean±SD表示，組間比較采用方差分析，計數(shù)資料比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外實驗結(jié)果

2.1.1 COS對OS－RC－2腎癌細(xì)胞體外生長抑制作用

OS－RC－2腎癌細(xì)胞在100和300mg／L COS培養(yǎng)條件下，與對照相比，細(xì)胞生長受到明顯抑制（F＝69.21，q＝11.32、19.35，P＜0.05），其他組抑制效果不明顯（見表1）。

2.1.2 COS對 OS－RC－2腎癌細(xì)胞體外凋亡作用100和300mg／L的COS劑量組腎癌細(xì)胞OS－RC－2的凋亡率要明顯高于對照組（F＝205.72，q＝31.52、23.21，P＜0.01），即中等劑量組的 COS可明顯促進(jìn)OS－RC－2腎癌細(xì)胞的凋亡（見表1）。

2.1.3 COS對OS－RC－2腎癌細(xì)胞的細(xì)胞周期影響與對照組相比，100mg／L的COS可使滯留在G0／G1期的癌細(xì)胞比例顯著增高，而使S期和G2／M期的癌細(xì)胞比例顯著降低，300mg／L COS對腎癌細(xì)胞的生長也有一定的阻滯作用（x2＝22.54，P＜0.05），其他組作用效果不顯著（見表2）。

表1 COS對OS－RC－2腎癌細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響（mean±SD，n＝6）Table 1 The proliferation and apoptosis of kidney cancer cell OS－RC－2with COS in vitro（mean±SD ，n＝6）

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測COS對OS－RC－2細(xì)胞周期影響Table 2 The infiuence of OS－RC－2cell circle with COS by flow cytometry ／%

2.2 體內(nèi)實驗結(jié)果

2.2.1 不同濃度COS對OS－RC－2腫瘤生長抑制率的影響 環(huán)磷酰胺組和不同劑量COS組腫瘤質(zhì)量都明顯低于模型對照組（F＝345.72，q＝43.19～54.56，P＜0.05）。100、300mg／kg COS劑量組的抑癌效果顯著（F＝148.39，q＝25.05、15.10，P＜0.05），其他劑量組與模型對照組相比差異無顯著性（見表3）。

表3 不同濃度COS對OS－RC－2腎腫瘤抑制結(jié)果（mean±SD，n＝6）Table 3 The inhibitory of renal carcinoma OS－RC－2with different concentration of COS.（mean±SD，n＝6）

2.2.2 不同劑量的COS對移植瘤VEGFmRNA表達(dá)水平的影響 環(huán)磷酰胺組、100和300mg／kg COS組VEGF mRNA表達(dá)水平明顯低于模型對照組（F＝172.05，q＝25.27～35.50，P＜0.01），其他組差異無顯著性（見圖1和表4）。

表4 COS對OS－RC－2移植瘤VEGF mRNA及其蛋白陽性率的影響（mean±SD，n＝6）Table 4The VEGF mRNA and protein expression of transplant tumor OS－RC－2with COS（mean±SD，n＝6）

2.2.3 COS對 OS－RC－2腫瘤組織 VEGF蛋白表達(dá)的影響 COS灌胃15d后，模型對照組OS－RC－2轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞胞質(zhì)中有大量VEGF蛋白免疫陽性黃褐色染色顆粒。與模型對照組相比，陽性對照組、100和300 mg／kg COS組僅有少量陽性染色顆粒（F＝88.48，q＝25.58、20.25，P＜0.01），其他劑量組 VEGF蛋白免疫陽性染色較強(qiáng)（見圖2和表4）。

圖2 VEGF樣品免疫組化染色圖片（400×）Fig.2 The immunohistochemical staining for VEGF of the samples（400×）

2.2.4 透射電鏡觀察OS－RC－2腎癌細(xì)胞的凋亡 模型對照組可見腫瘤細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核呈橢圓形，線粒體較多，核染色質(zhì)無邊聚現(xiàn)象，電子密度較低；100和300mg／kg COS組可見腫瘤細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核異型性大，周圍有大量的膠質(zhì)纖維形成，核染色質(zhì)固縮，邊聚，線粒體部分呈空泡狀，電子密度較高（見圖3）。

圖3 透射電鏡觀察腎癌細(xì)胞OS－RC－2的凋亡（7000x）Fig 3 The apoptosis of renal carcinoma OS－RC－2by TEM（7000x）

3 討論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴豐富的血液供應(yīng)，因此需要大量的新生血管的生成。大量研究證實，VEGF及其受體是介導(dǎo)新生血管生成的關(guān)鍵因素，它促使血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂并最終形成大量的新生血管，是刺激腫瘤血管的生成中最強(qiáng)的細(xì)胞因子［11］。血管內(nèi)皮生長因子－血管內(nèi)皮生長因子受體（（VEGF－VEGFR）、血管生成素（Ang）－Tie2及 Delta－like ligan4（Dll）－Nortch信號通路作為血管生成中的3條主要的信號傳導(dǎo)通路，它們各自作用并互相影響、共同協(xié)調(diào)，促進(jìn)血管的生成。VEGF－VEGFR信號通路是血管生成中主要的信號通路，阻斷VEGF－VEGFR通路是腫瘤治療中首個治療策略。VEGF不僅可激活A(yù)ng受體從而發(fā)揮其作用，還可以誘導(dǎo)Dll－Nortch信號，同時還受到Dll－Nortch信號的調(diào)節(jié)。生理性或者病理性的血管生成正是在多條血管通路的共同作用下完成的［12－14］。

VEGF由7個內(nèi)含子及8個外顯子交替構(gòu)成，其mRNA的不同的剪切方式形成分為5種單體，VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF 206［15，17］。其中 VEGF165是 VEGF最重要的同源單體，其含量最多，分裂原性也最強(qiáng)［13］。有研究證實，Ad－VEGFl65轉(zhuǎn)染BGC－823細(xì)胞后可上調(diào) Bcl－2mRNA蛋白的表達(dá)，因而認(rèn)為VEGFl65可通過上調(diào)Bcl－2的表達(dá)而抑制癌細(xì)胞的凋亡［18－19］。因此抑制 VEGF mRNA的表達(dá)，可阻斷腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤的生長。

本研究以VEGF165作為檢測對象，通過RT－PCR和免疫組化檢測COS小鼠灌胃15d后，腎腫瘤組織中VEGF mRNA及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，中劑量的COS可顯著降低腫瘤中VEGF mRNA及其蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管的形成及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，使腫瘤饑餓致死；透射電鏡可見腫瘤細(xì)胞體積縮小和異型性改變，周圍有大量的膠質(zhì)纖維形成，核染色質(zhì)固縮，邊聚，線粒體部分呈空泡狀，電子密度高等凋亡細(xì)胞的特征，與MTT實驗和AO／EB實驗結(jié)果相符。

綜上所述，COS可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且抑瘤作用有一定的濃度范圍，中劑量的COS抑瘤效果最佳。

［1］ Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60：277－300.

［2］ Campbell S C，Novick A C，Bukowski R M.Renal tumors［M］.Philadelphia：Campell’s Urology，2007：1651－1725.

［3］ Herrmann E，Bierer S，Wülfing C.Update on systemic therapies of metastatic renal cell carcinoma［J］.World J Urol，2010，28：303－309.

［4］ Kirchner H，Strumberg D，Bahl A，et al.Patient－based strategy for systemictreatment of metastatic renal cell carcinoma［J］.Expert Rev Anticancer Thera.2010，10：585－596.

［5］ Fu D W，Han B Q，Dong W，et al.Effects of carboxymethyl chitosan on the blood system of rats［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，408：110－114.

［6］ Zheng M L，Han B Q，Yang Y，et al.Synthesis，charcterization and biological safety of O－carboxymethyl chitosan used to treat Sarcoma 180tumor［J］.Carbohydrate Polymers，2011，86：231－238.

［7］ Xu Q S，Bai X F，Du Y G.Progress on Anti－tumor Activity of Oligochitosan and Its Derivates［J］.Food and Drug，2008，10（5）：60－62.

［8］ 劉清華，孔慶兗，柳紅.殼寡糖對S180肉瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Bax的影響［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，26（4）：290－293.

［9］ Pae H O，Seo W G，Kim N Y，et al.Induction of granulocytic differentiation in acute promyelocytic leukemia cells（HL－60）by wa－ter－soluble chitosan oligomer［J］.Leuk Res，2001，25（4）：339－346.

［10］ Wang X B，Liu Q H，Wang P，et al.Study of cell killing effect on RENAL CARCINOMA OS－RC－2by ultrasound activating protoporphyrin IX［J］.Ultrasonics，2008，48：135－140.

［11］ 徐文華，葛銀林.siRNA對胃腺癌細(xì)胞株SGC－7901血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)的作用［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，42（3）：222－224.

［12］ Gaur P，Bose D，Samuel S，et al.Targeting tumor angiogenesis［J］.Semin Oncol，2009，36（Sup）：12－19.

［13］ Li J L，Harris A L.Croestalk of VEGF and North pathways in tumor angiogenesis；therapeutic implications［J］.Front Bioeci，2009，14：3094－3110.

［14］ Wang J F，Zhang X，Groopman J E，et al.Activation of vascular endothelial growth factor receptor－3and its downstream signaling promote cell survival under oxidative stress［J］.J Biol Chem，2004，279（26）：27088－27097.

［15］ Timmons L，F(xiàn)ire A.specific interference by ingested dsRNA［J］.Nature，1998，395：854.

［16］ Brantl S.Antisense－RNA regulation and RNA interference［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1575：15－25.

［17］ Agami R.RNAi and related mechanisms and their potential use for therapy［J］.Curr Opin Chem Biol，2002，6：829－834.

［18］ Shi Y.Mammalian RNAi for the masses［J］.Trends Genet，2003，19：9－12.

［19］ 歐希龍，關(guān)云燕，顏芳，等.血管內(nèi)皮生長因子1 65基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞凋亡的影響及機(jī)制［J］.世界華人消化雜志，2008，16（3）：307－310.