田金虎，鄭明剛，鄭 立，肖立家，李建波

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子832003；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島266061；3.大唐山東發(fā)電有限公司，山東 青島266061）

近年來，由于全球石化燃料消費量的激增、石化儲量的減少，引起了世界范圍內的能源危機，尋找一種廉價的綠色可再生能源已成為世界各國政府以及民眾廣泛關注的科學與社會問題［1－3］。微擬球藻（Nannochloropsis sp.）屬于褐藻門，大眼藻綱，單珠藻科。它的油脂含量占干重的比重達68%以上，油脂以C16和C20脂肪酸為主。相對于目前的生物質燃料而言，微擬球藻是公認的最有希望用于工業(yè)化的高產(chǎn)油海水藻［4］。微擬球藻生產(chǎn)生物柴油具有光合作用效率高、環(huán)境適應能力強、生長周期短、不受氣候限制、培養(yǎng)不占用耕地、易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點［5－6］。但是，微擬球藻生物柴油的開發(fā)仍面臨許多瓶頸，高昂的成本讓其產(chǎn)業(yè)化步履維艱。如果微擬球藻的油脂含量得到大幅增加，則意味著利用其制造生物柴油將更具有競爭力。

隨著分子生物學的發(fā)展，更多的科研工作者希望通過基因工程技術對微藻進行改造，以期獲得高油脂含量的藻株。相比于大豆﹑油菜、酵母等［7－10］其他基因工程研究開展的比較早的物種而言，微擬球藻產(chǎn)油的研究還處在初級階段，現(xiàn)有的微擬球藻分子生物學研究還局限于對少量基因的克隆﹑分析及表達研究［11－12］。對于微擬球藻生長發(fā)育、抗逆、產(chǎn)油等的調控機制，還需要大量的基礎研究工作。

轉錄組分析是在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規(guī)律的分析方法，高通量測序技術如羅氏454、Illumina等是研究植物﹑微生物等轉錄組最常用的方法［13－14］，它們具有高通量﹑高準確性﹑高靈敏度和低運行成本等突出優(yōu)勢［15］。通過高通量測序技術，每一個樣品可以產(chǎn)生數(shù)百萬個mRNA標簽，這些標簽幾乎涵蓋了單個細胞所有的mRNA，這為確認轉錄組功能信息提供了有力的技術保障。本研究針對微擬球藻指數(shù)期和平臺期基因表達調控模式和表達量的變化，采用高通量測序技術對微擬球藻不同生長時期的轉錄組進行測序，以期豐富微擬球藻油脂代謝調控及轉錄組學相關基礎理論，闡明微擬球藻油脂積累與相關基因表達差異的關系，為構建富油微擬球藻工程藻株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗選用國家海洋局第一海洋研究所藻種庫的微擬球藻藻種（Nannochloropsis gaditana HH－1），采用f／2培養(yǎng)基培養(yǎng)［16］，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度8 000lx，光暗比為12h／12h，在微擬球藻生長的指數(shù)期和平臺期分別取樣［17］，4℃、5 000r／min離心5min后液氮速凍，放入－80℃保存，用于總RNA提取。

1.2 總RNA提取

指數(shù)期和平臺期總RNA提取方法參照Invitrogen公司的Trizol Reagent說明書并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測確定總RNA質量。

1.3 樣品的前處理及測序

將符合條件的指數(shù)期和平臺期提取的總RNA用含有oligo－dT的Beads與mRNA上的poly－A結合，純化出mRNA，然后用化學加高溫的方法將mRNA打斷成155bp左右的短片段。以mRNA為模版，用隨機引物合成第一條cDNA鏈，加入緩沖溶液、dNTPs、RNase H、DNA polymerase I合成第二條cDNA 鏈，并通過3′－5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修復帶有突出末端的DNA片段。在修復平整的DNA片段3′端引入單堿基“T”，在連接酶的作用下，孵育含有標簽的接頭與DNA片段使其相連。用AMPure XPbeads純化游離的接頭和沒有連上接頭的片段，然后用PCR有選擇性的富集DNA片段，同時擴增DNA文庫。最后用Pico green和熒光分光光度計定量文庫，并使用Agilent 2100對PCR富集片段進行質量控制，驗證DNA文庫的片段大小及分布，將得到的樣品逐步稀釋到4～5pmol／L后進行上機測序。

1.4 序列分析

利用HiSeq 2000平臺獲得微擬球藻指數(shù)期和平臺期的圖像序列信息，然后將所得圖像數(shù)據(jù)轉化為相應的核苷酸序列（Raw reads），并對所產(chǎn)生的核苷酸序列進行可信度分析及質量評估。去除核苷酸序列中低質量和低復雜的序列，然后用Velvet和Oases軟件進一步進行轉錄組裝和拼接（K＝47，length＿300，其他默認），用于獲得相關序列。

1.5 轉錄組表達差異及KEGG代謝通路分析

分析轉錄組整體表達情況，使用RPKM值（Reads per kb per million reads）［18］計算基因表達量，并利用2－fold法統(tǒng)計指數(shù)期和平臺期序列的RPKM值差異（定義：一條序列的RPKM值在指數(shù)期大于或等于平臺期的2倍，則為指數(shù)期表達上調，反之則為平臺期表達上調。若兩時期RPKM值差異不超過2倍，則為表達無差異）。將全部序列在KEGG pathway數(shù)據(jù)庫對比，獲得相關序列的代謝通路注釋及在代謝通路中的具體位置信息［19］，然后對2個時期參與脂質代謝途徑的序列進行統(tǒng)計分析。

1.6 序列比對、COG功能注釋及分類

將所得的序列與SwissProt、nr數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析，統(tǒng)計與數(shù)據(jù)庫中已收錄基因具有高度相似性的序列，獲取最佳注釋（E－value＜10－5）。然后將所有序列在COG數(shù)據(jù)庫［20］（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／COG）中進行比對分析（E－value＜10－5），獲得微擬球藻表達序列的COG功能注釋及分類。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量及測序文庫質量的檢測

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示5S、18S及28SRNA條帶完整，RNA純度較高。紫外分光光度檢測表明在指數(shù)期和平臺期A260／A280均不小于1.8，表明總RNA質量較好。對2個時期總RNA樣品分別進行處理后，參照試劑盒說明書（Agilent 2100DNA 1000Kit）對樣本文庫進行大小質檢，檢測結果顯示兩時期文庫大小均在280～320bp之間，可以滿足測序和分析要求。

2.2 序列拼接

全部數(shù)據(jù)經(jīng)去除雜質及低質量片段后，用Velvet軟件和Oases軟件進行轉錄序列組裝。2個時期共獲得29 203條序列，序列長度主要分布在100～3 000bp范圍內。大于3 000bp的序列有1 642條，占序列總量的17.78%。200～1 600bp范圍內的序列數(shù)量最多，占全部序列數(shù)量的67.71%，序列長度分布見圖1。

圖1 Unigene長度分布圖Fig.1 Length distribution of unigenes

2.3 基因整體表達差異

利用RPKA值對基因表達量進行計算，并用2－fold法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，分析結果見圖2。在整個轉錄組序列數(shù)據(jù)中，指數(shù)期表達上調的序列有7 305條，平臺期表達上調的序列有9 745條，2個時期表達沒有差異的序列有12 153條。微擬球藻在指數(shù)期主要進行的生物學過程為生長和增殖，而平臺期主要為油脂等次級代謝產(chǎn)物的積累，基因表達差異從整體上反映了微擬球藻2個時期基因表達的變化過程，為下一步利用相關基因去進行轉基因高產(chǎn)油微藻奠定了基礎。

圖2 表達差異分布圖Fig.2 Expression level different dot plot

2.4 KEGG pathway注釋分析及脂質代謝相關分析

對全部序列進行KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫比對和注釋，結果表明指數(shù)期涉及238種代謝途徑，表達上調的序列有818條；平臺期涉及248種代謝途徑，表達上調的序列有1 148條。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期和平臺期關于脂質代謝的序列總共有195條，指數(shù)期有53條序列表達上調，平臺期有47條序列表達上調，這些關于脂質代謝的序列分屬于14種代謝途徑。在甘油磷酸酯代謝途徑（Glycerophospholipid metabolism）中指數(shù)期和平臺期分別有7、5條序列表達上調；脂肪酸代謝途徑（Fatty acid metabolism）中指數(shù)期和平臺期分別有12、11條序列表達上調；甘油脂類代謝途徑（Glycerolipid metabolism）中指數(shù)期和平臺期分別有6、2條序列表達上調；不飽和脂肪酸生物合成途徑（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）中指數(shù)期和平臺期分別有5、8條序列表達上調；鞘脂類代謝（Sphingolipid metabolism）中指數(shù)期和平臺期分別有6、5條序列表達上調；類固醇生物合成途徑（Steroid biosynthesis）指數(shù)期和平臺期分別有11、10條序列表達上調；脂肪酸生物合成途徑（Fatty acid biosynthesis）中指數(shù)期有1個序列表達上調；花生四烯酸代謝途徑（Arachidonic acid metabolism）中指數(shù)期和平臺期分別有3、4條序列表達上調；合成和降解酮體途徑（Synthesis and degradation of ketone bodies）中平臺期1個序列表達上調；初級膽汁酸生物合成途徑（Primary bile acid biosynthesis）及類固醇生物激素合成途徑（Steroid hormone biosynthesis）中2個時期無表達差異基因存在；亞麻酸代謝途徑（alpha－Linolenic acid metabolism）中指數(shù)期有1個序列表達上調；醚酯類代謝途徑（Ether lipid metabolism）中2個時期無表達差異基因存在；脂肪酸延伸途徑（Fatty acid elongation）中指數(shù)期和平臺期分別有1個序列表達上調（見圖3）。

圖3 脂質代謝途徑分類及Unigene數(shù)量Fig.3 The category of lipid metabolism pathway and number of Unigenes

2.5 轉錄組序列COG功能注釋及分類

為了從整體上了解轉轉錄組序列信息，首先利用NCBI中的nr數(shù)據(jù)庫和Swissprot數(shù)據(jù)庫對上述29 203條轉錄組數(shù)據(jù)進行比對分析，統(tǒng)計與已知基因序列具有高相似性的片段。結果顯示，在29 203條序列中，47.16%的序列（13 775條）能夠比對到數(shù)據(jù)庫中已收錄基因，15 428（52.82%）條序列沒有命中任何已知基因（E－value＜10－5）。隨后用COG數(shù)據(jù)庫對所有序列進行比對和功能注釋（E－value＜10－5），共獲得11 604條具有COG功能注釋的序列，占總轉錄組序列數(shù)目的39.74%，涉及25個COG功能類別（見圖4）。總體上看，在具有COG功能注釋的序列中，指數(shù)期表達上調的序列有4 135條，平臺期表達上調的序列有5 015條。其中，在指數(shù)期，一般功能基因（General function prediction only）的序列比例最大，為13.06%；其次為蛋白質翻譯后修飾與轉運及分子伴侶相關基因（Posttranslational modification，protein turnover，chaperones）和信號轉換機制相關基因（Signal transduction mechanisms），所 占 比 例 分 別 為 11.68% 和11.05%。而在平臺期，翻譯、核糖體結構和生物起源相關基因（Translation，ribosomal structure and biogenesis）最多，為14.00%。其次為一般功能基因（General function prediction only）和蛋白質翻譯后修飾與轉運及分子伴侶相關基因（Posttranslational modification，protein turnover，chaperones），分 別 為12.84%和11.31%。在COG功能注釋中，涉及能量代謝過程相關功能定義主要包括能量產(chǎn)生、保存（Energy production and conversion）、脂質轉運和代謝（Lipid transport and metabolism），在指數(shù)期分別有189條和174條序列表達上調，而在平臺期分別有249條和211條序列表達上調。微擬球藻在平臺期進行油脂的積累，這可能與在平臺期表達的能量代謝相關基因數(shù)目相對比指數(shù)期高有關。在指數(shù)期，微擬球藻主要進行細胞生長和增殖，因此細胞循環(huán)控制及分化、染色體分裂及糖類轉運和代謝、細胞運動性等相關功能分類的基因表達上調的數(shù)目要比平臺期多。細胞核結構功能相關的序列在指數(shù)期和平臺期表達上調的數(shù)目均較少，分別有6條和7條。

圖4 COG分類及表達水平差異Fig.4 COG Group analysis and different expression level

3 結語

目前，關于微藻產(chǎn)油的研究主要集中在對油脂代謝相關基因的克隆、表達上，但結果卻不盡如人意。美國國家可再生能源實驗室（NREL）最早開展了利用ACCase基因的過量表達構建高油微藻的工作，微藻油脂含量并沒有明顯提高［11，21］。對于甘油三酯組裝過程中的其他酶如甘油3－磷酸脫氫酶，脂肪酸轉移酶系等，它們基因的過量表達在高等植物中都能促進油脂積累［22－24］，但在微藻上還未開展相應研究。有研究表明，球等鞭金藻（Isochrysis galbana）在平臺期改變與脂肪酸生物合成相關的碳代謝［25］，光固定的碳更多地進入脂類合成途徑而使其細胞中脂類和碳水化合物得到積累［26］；蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）等15種綠藻平臺期總脂含量可比指數(shù)期多1.3～1.5倍［27］。但關于微擬球藻平臺期和指數(shù)期總脂含量的差異研究還沒有和其對應時期基因表達的差異聯(lián)系起來。作者希望從不同時期基因表達差異的角度去探討與脂質積累相關的生物學過程，然后從中發(fā)現(xiàn)相關基因，進行克隆表達，通過基因工程獲得油脂含量更高的微擬球藻改良藻種。

本文首次采用HiSeq 2000高通量測序技術初步建立了微擬球藻指數(shù)期和平臺期轉錄組的表達圖譜，闡明了在指數(shù)期和平臺期基因表達的種類、數(shù)量，初步明確了部分編碼蛋白質的功能、分類及在指數(shù)期和平臺期表達量的差異。并分析了與脂質代謝相關的代謝通路，闡明了與脂質代謝相關的基因在代謝通路中的位置，探討了基因表達差異和微擬球藻油脂代謝等的調控關系。通過對指數(shù)期和平臺期的轉錄組差異比較，發(fā)掘參與微藻油脂積累的相關基因，從基因表達差異的角度對微藻油脂積累進行研究，為進一步研究微擬球藻提供理論指導和技術支持。

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