趙小波 , 逄少軍 劉 峰

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

江蘺屬(Gracilaria)海藻在自然分類上隸屬于紅藻門(Rhodophyta), 江蘺目(Gracilariales), 江蘺科(Gracilariaceae), 廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶海域, 是世界范圍內(nèi)十分重要的經(jīng)濟海藻[1]。江蘺屬中栽培的物種主要是龍須菜、細基江蘺、脆江蘺, 還有智利的智利江蘺。龍須菜栽培主要在我國廣東、福建、山東沿海, 其主要用途是提取瓊膠、鮑魚餌料、食用等。江蘺屬內(nèi)其他物種也是重要的食品以及工業(yè)原料。因此, 江蘺屬海藻產(chǎn)業(yè)市場發(fā)展?jié)摿Υ?。目? 江蘺屬海藻的研究還存在一些問題: 由于缺乏足夠的證據(jù), 這些海藻之間復雜的分類關(guān)系尚未完全厘清[2], 例如傳統(tǒng)分類學家將龍須菜歸入江蘺屬[3],但是許多分子生物學證據(jù)認為龍須菜并不隸屬于江蘺屬[2,4-5]; 雖然分子生物學手段越來越多的被應用于江蘺屬系統(tǒng)分類研究之中, 但大多數(shù)研究局限于ITS以及rbcL序列, 且研究結(jié)果存在差異[4-9]; 此外,雖然分子系統(tǒng)學研究進展迅速, 但是一個可信度較高的系統(tǒng)分類結(jié)果對于系統(tǒng)分類學家來說仍然是困難的。單純憑借一個DNA序列進行分析, 往往會由于進化速率不同等因素導致在不同的研究中得出完全不同甚至是錯誤的結(jié)論。為了更清楚的了解中國科學院海藻種質(zhì)庫活體保存的不同江蘺屬海藻物種在分類進化上的關(guān)系, 作者利用核基因編碼的18S rRNA基因、位于線粒體的cox2-3間隔區(qū)、以及位于葉綠體的RUBISCO間隔區(qū)研究了來自不同地區(qū)的5個物種, 并與GenBank中已知相關(guān)序列進行比對分析, 力圖從分子水平上闡明江蘺屬系統(tǒng)進化關(guān)系,為江蘺屬的系統(tǒng)進化、種質(zhì)鑒定等提供新的佐證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用江蘺屬、Gracilariopsis屬樣品采集自我國不同海區(qū)(表1)。所有樣品首先依照形態(tài)學特征進行分類鑒定[3,10-11], 在提取DNA之前, 將藻體用消毒海水清洗, 活體保存于中國科學院海洋研究所海藻種質(zhì)庫。

1.2 總DNA提取與PCR擴增

總DNA提取參考Goff[12]的方法, 并對部分細節(jié)進行了改動。將藻體用消毒海水清洗干凈之后, 取0.1g于液氮中充分研磨后, 加入大約2mL提取緩沖液[4% SDS, 0. 05 mol/ LTris. HCl, 0. 1 mol/ L EDTA,0.2 mol/ L NaCl], 加蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL,然后震蕩3～4h (50 ℃ ), 12000 r/min 離心10 min, 取上清后加等體積的酚抽提, 12000r/min離心10min取上清, 再以酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)及氯仿抽提,12000r/min離心10min取上清。上清液加入2倍的無水乙醇和1/10體積的醋酸鉀離心, 70%乙醇洗滌2次, 干燥后, 溶解在50μL無菌三蒸水儲存?zhèn)溆谩２伤崛NA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。使用PCR技術(shù)[13]擴增18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)序列。用于18S rRNA序列擴增的引物為: 18SF 5-CAACCTG GTTGATCCTGCCAGT-3; 18SR 5-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3。擴增程序為: 94℃預處理5 min后, 94 ℃變性1min, 60℃復性2min, 72℃延伸4min, 總35個循環(huán), 最后在72℃延伸7min, 4℃保存[2]。cox2-3間隔區(qū)擴增引物為: coxF 5-GTACCWTCTTTDRGRRK DAAAT GTGATGC-3;coxR 5-GGATCTACWAGATGRAAWGGATGTC-3。擴增程序為: 94℃預處理4 min后, 93 ℃變性1min,45℃復性1min, 72℃延伸1min, 總5個循環(huán), 然后93℃變性30s, 55℃復性30s, 72℃延伸30s, 總30個循環(huán)。最后在72℃延伸5min, 4℃保存[14]。RUBISCO間隔區(qū)序列擴增引物為: rbcF 5-TATACTTCTACAGACACAGCTGA-3; rbcR 5-ATGTCAAATAATGGTAGT CCCCA-3。擴增程序為: 94℃預處理4 min后, 93 ℃變性1min, 45℃復性1min, 72℃延伸1min, 總5個循環(huán), 然后93℃變性1min, 55℃復性1min, 72℃延伸1min, 總30個循環(huán)。最后在72℃延伸5min, 4℃保存[15]。

PCR反應體系20μL包括: 10×PCR反應緩沖液,MgCl2(25mmolL-1)1.5μL, dNTPs (2.5 mmolL-1)2μL,Taq (5UμL-1)0.2μL, 引物 (10 mmolL-1)0.5μL,ddH2O 12.3μL。所有PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司(Takara, Dalian)。

PCR產(chǎn)物用UNIQ-10 PCR Purification Kit試劑盒(上海生工)膠回收純化。純化產(chǎn)品與pMD19-T載體(大連寶生物工程有限公司)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coliTOP 10(北京全是金生化科技有限公司)中, 經(jīng)氨芐青霉素(AMP)抗性篩選后, 隨機挑取5個陽性克隆進行擴大培養(yǎng), 菌液PCR擴增預檢測插入片段大小, 委托上海生工進行雙向測序。所得PCR產(chǎn)品序列上傳至GenBank。

表1 樣品采集信息Tab.1 Information of algal samples

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列數(shù)據(jù)首先利用BLAST與GenBank中已有序列信息進行比對。然后利用ClustalW軟件對測序數(shù)據(jù)進行人工對齊排序。用MEGA 5.0計算其堿基含量和變異位點, 并選擇Kimura 2-parameter公式[16]計算遺傳距離。并在MEGA5.0中采用最大簡約法(Maximum parsimony, MP)構(gòu)建系統(tǒng)樹, 自舉值Bootstrap為1000次重復。保留大于60的Bootstrap數(shù)值。選擇線形紫菜(Porphyra linearisGreville)作為外群。

2 結(jié)果

2.1 18S rRNA序列分析結(jié)果

所有樣品擴增條帶去除引物后, 序列長度一致,均為1722bp。江蘺屬海藻不同樣品堿基頻率一致, 均為A: 25.1%; T: 25.9%; G: 28.3%; C: 20.7%。龍須菜堿基頻率與江蘺屬略有不同A: 25.1%; T: 25.5%; G:28.5%; C: 20.9%。江蘺屬樣品轉(zhuǎn)換/顛換比例(R)為1.42。江蘺屬種間遺傳距離為0.005～0.017, 共計61個變異位點; 江蘺屬與龍須菜物種間的遺傳距離在0.019～ 0.028 (表2), 共計90個變異位點。采自不同地區(qū)的龍須菜種內(nèi)遺傳距離為0.000, 變異位點為0個。與GenBank下載的數(shù)據(jù)人工比對之后序列長度為1699bp, 可分為2大分支, 包括龍須菜分支, 江蘺屬分支。其中, 脆江蘺Gracilaria chouae與扁江蘺G.textorii聚合, 形成分支Ⅰ; 真江蘺Gracilaria vermiculophylla形成分支Ⅱ;G. debilis,G. fergusonii, G.salicornia與G. foliifera聚合組成分支Ⅲ(圖1)。

表2 基于18S rRNA序列的樣品間遺傳距離Tab.2 Genetic distance calculated using Kimura 2-parameter model for 18S rRNA sequences of samples

圖1 樣品18S rRNA序列系統(tǒng)進化樹Fig.1 Maximum-parsimony (MP)phylogeny estimated using 18S rRNA sequence

2.2 COX2-3序列分析結(jié)果

目的片斷去除擴增引物之后, 江蘺屬海藻大小為343bp, 片段堿基頻率略有不一, 平均GC含量為24.43%。龍須菜片段大小略長, 為347bp, GC含量為22.2%。江蘺屬樣品轉(zhuǎn)換/顛換比例(R)為 1.32。江蘺屬海藻種間遺傳距離為 0.105～0.221, 共計 102個變異位點, 江蘺屬與龍須菜屬間的遺傳距離為0.196～0.244, 變異位點共計112個, 龍須菜群體內(nèi)遺傳距離為 0.000(表 3), 變異位點 0個。與 GenBank下載的數(shù)據(jù)人工比對之后長度為310bp。江蘺屬與龍須菜在系統(tǒng)樹上分為兩大分支, 龍須菜位于系統(tǒng)樹的最基部。江蘺屬中, 扁江蘺與脆江蘺聚成分支Ⅰ;真江蘺與細基江蘺繁殖變種,G. foliifera聚成分支Ⅱ;G. dura與G. debilis分別聚成分支Ⅲ(圖2)。

表3 基于cox2-3間隔區(qū)序列的樣品間遺傳距離Tab.3 Genetic distance calculated using Kimura 2-parameter model for cox2-3 intergenic spacer sequences of samples

圖2 樣品cox2-3間隔區(qū)序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Maximum-parsimony (MP)phylogeny estimated using cox2-3 intergenic spacer sequence

2.3 RUBISCO spacer序列分析結(jié)果

目的片段去除擴增引物后, 江蘺屬海藻大小不一為 246～289bp, 平均 GC 含量為 49.7%; 龍須菜RUBISCO spacer序列長度為 289bp, GC含量為47.4%。江蘺屬樣品轉(zhuǎn)換/顛換比例(R)為 1.41。江蘺屬海藻種間遺傳距離為0.048～0.215, 共有78個變異位點; 江蘺屬與龍須菜之間的遺傳距離為0.190～0.259, 共計86個變異位點。龍須菜群體遺傳距離為0.000(表4), 變異位點0個。樣品與GenBank下載的數(shù)據(jù)人工比對后長度為237bp, 系統(tǒng)進化樹有2大分支, 江蘺屬與龍須菜。江蘺屬分支由4個小分支組成。其中, 扁江蘺與脆江蘺聚成分支Ⅰ,G.salicornia與G. fergusonii分支Ⅱ、G. dura與G. debilis聚成分支Ⅲ, 真江蘺與細基江蘺繁殖變種聚成分支Ⅳ。G. gracilis處于江蘺屬分支的基部。龍須菜處于整個進化樹的基部(圖3)。

表4 基于RUBISCO間隔區(qū)序列的樣品間遺傳距離Tab.4 Genetic distance calculated using Kimura 2-parameter model for RUBISCO spacer sequences of samples

圖3 樣品RUBISCO間隔區(qū)序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Maximum-parsimony (MP)phylogeny estimated using RUBISCO spacer sequence

3 討論

歷史上, 關(guān)于龍須菜的分類地位一直存有爭議[17]。Papenfuss[18]認為龍須菜隸屬江蘺屬, 我國2007年出版的《中國黃渤海海藻》一書仍然將龍須菜歸于江蘺屬[11]。但近10年來, 越來越多的分子生物學研究結(jié)果表明龍須菜并不隸屬于江蘺屬。在本研究中, 位于基因組不同位點的18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)3個序列進行系統(tǒng)進化分析的結(jié)果表明: 龍須菜位于進化樹的基部, 單獨成支, 說明其與江蘺屬相比, 其分化較早, 相對原始; 并且龍須菜與江蘺屬海藻具有較遠的遺傳距離。這些結(jié)果進一步印證了Gurgel等人基于rbcL序列的研究結(jié)果[19]。他們認為, 江蘺科的物種在進化上是多起源的, 而龍須菜所在Gracilariopsis屬較早出現(xiàn)了分化, 逐步進化成獨立于另外2個江蘺屬的單獨一支, 因此龍須菜不應隸屬于江蘺屬。在本研究中, 扁江蘺與脆江蘺,G.dura與G. debilis在三個系統(tǒng)樹中均聚合成支, 顯示了它們之間具有較近的親緣關(guān)系。Pareek等[20]研究了印度沿海地區(qū)江蘺屬海藻系統(tǒng)進化關(guān)系, 他們發(fā)現(xiàn)G.foliifera與G. corticata的兩個變種(var. corticata和cylindrica)具有很近的親緣關(guān)系;G. salicornia和G.fergusonii可能是由共同祖先進化而來; 而G. gracilis與其他江蘺屬海藻的親緣關(guān)系較遠。這一點, 在作者的結(jié)果中得到了證實,G. gracilis與其他樣品之間也具有明顯較遠的親緣關(guān)系。G. gracilis處于江蘺屬分支的最底部, 說明其分化較早, 屬于江蘺屬內(nèi)較為原始的物種。

本研究結(jié)果顯示基于cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)的進化樹有相似的關(guān)系, 但是與基于18S rRNA的進化樹又略有不同。原因在于相對于cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)序列, 18S rRNA序列則更加保守。早在上世紀90年代, Bird[21-22]就發(fā)現(xiàn)18S rRNA序列不能在種水平區(qū)分江蘺科海藻, Bellorin[2]以及Iyer[4]均取得了類似結(jié)論。Medlin指出使用18S rRNA序列研究系統(tǒng)進化具有一些缺陷: 對于親緣關(guān)系較近的物種的分辨度不足[23]。在作者的研究中也發(fā)現(xiàn)cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)的保守性要弱于18S rRNA序列, 能更好的反應江蘺屬海藻的系統(tǒng)進化關(guān)系。

本實驗使用了18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)這3個序列, 而沒有采用ITS序列。原因在于: 第一, 之前已經(jīng)有相當多的工作使用ITS序列研究江蘺科的海藻[5,9]; 第二, Saunders發(fā)現(xiàn)ITS序列在紅藻中具有一定的多態(tài)性問題[24]。雖然李敏等[9]認為來自同一居群龍須菜個體的ITS序列相同,但是在作者之前的研究中擴增江蘺屬真江蘺的ITS序列時確實遇到了這一問題[25], 因此如果使用ITS序列研究整個江蘺屬海藻, 有可能會對后續(xù)的工作造成不同程度的干擾。同時, 18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)這3個序列尚未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性問題,這也是作者選擇這三個序列的原因之一。

隨著分子生物學的不斷發(fā)展, 相關(guān)生物學數(shù)據(jù)的不斷積累, 利用DNA序列研究物種系統(tǒng)進化, 已經(jīng)成為生物學研究十分有利的工具。但目前來看, 還存在相當多的問題。例如, 不同種群同一DNA序列,同一種群不同DNA序列的進化速率都有可能存在差異。因此, 利用基因組不同位點的基因系統(tǒng)地研究海藻的基因進化關(guān)系就顯得更為重要和迫切, 這樣得到的結(jié)果相對單純憑借一個DNA序列進行分析, 會更加客觀, 全面。在本研究中, 作者使用核基因編碼的18S rRNA基因、位于線粒體的cox2-3間隔區(qū)、以及位于葉綠體RUBISCO間隔區(qū)這三個序列研究我國的江蘺屬海藻與龍須菜的系統(tǒng)進化, 研究結(jié)果進一步證明龍須菜并不隸屬于江蘺屬, 且相對原始。同時也表明: 扁江蘺與脆江蘺,G. dura與G. debilis具有較近的親緣關(guān)系;G. gracilis分化較早, 是江蘺屬內(nèi)較為原始的物種; cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)比起18S rRNA更適用于研究江蘺屬海藻的系統(tǒng)進化關(guān)系。

致謝: 感謝中國科學院海洋研究所夏邦美老師在物種分類鑒定方面的幫助與指導。本項目得到了中國科學院野生生物資源庫運補費項目的資助。

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