鮑文華，穆曉春，顧少巖，孫云暉，閻紅娥（.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江佳木斯 5400；.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科 6000）

肺間質(zhì)纖維化（IPF）是多種病因引起的異質(zhì)性疾病，病變局限于肺部，組織病理學(xué)和（或）影像學(xué)表現(xiàn)具有普通型間質(zhì)性肺炎（UIP）的特征［1］。本實驗用博來霉素制備肺纖維化動物模型，通過檢測白細(xì)胞介素17（IL－17）含量的變化，從而進(jìn)一步探討IPF的發(fā)病機制，為早期診斷及治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠64只，體質(zhì)量（240±20）g，清潔級，大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；動物合格證號ISCXK（遼）2008－0002，按清潔級標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng)。

1.1.2 主要實驗試劑 注射用鹽酸博來霉素，15毫克／支，日本化藥株式會社生產(chǎn)；IL－17酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均由天津市金圣生物試劑公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和模型制備 健康SD大鼠64只隨機分為健康對照組（N組）、肺纖維化模型組（B組）及地塞米松治療組（D組）。（1）B組制備：將大鼠麻醉，常規(guī)消毒后無菌操作下作頸中切口，逐層分離暴露氣管，并用彎尖眼科鉗經(jīng)氣管下方穿過，在直視下用針頭穿刺兩軟骨環(huán)間，抬高鼠板頭端，保持針頭與氣道方向相同，一次性將博萊霉素（BLM－A5）5mg／kg注入氣管，立即拔出針頭，豎立鼠板，保持大鼠直立體位，左右來回旋轉(zhuǎn)1～2min，使藥液盡可能到達(dá)兩側(cè)肺部。手術(shù)后縫合皮膚，置其于動物室喂養(yǎng)。（2）D組模型制備：在肺纖維化模型基礎(chǔ)上第8天開始每日腹腔注射地塞米松注射液3mg／kg。（3）N組：按照大鼠肺纖維化模型制備方法氣管內(nèi)注射0.9%生理鹽水注射液0.2～0.3mL。

1.2.2 動物的處死和標(biāo)本采集 分別于實驗的第7、14、28天將N組、B組各處死8只，D組于第14、28天各處死8只，方法是將大鼠眶后動脈放血處死，留取支氣管灌洗液，檢測IL－17含量；取右上肺置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，觀察肺組織結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化；留取右下肺組織，用于檢測IL－17和IL－17mRNA的含量；從肺組織上留取約50 mg肺組織，測肺組織勻漿中羥脯氨酸（HYP）含量。

1.2.3 在肺組織及支氣管灌洗液IL－17水平檢測 采用ELISA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 采用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測IL－17mRNA表達(dá) 采用Rat beta試劑提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA），以此為模板行PCR擴(kuò)增目的基因引物序列，IL－17上游引物：5′－GGG AAG TTG GAC CAC CAC AT－3′；下游引物：5′－TTC TCC ACC CGG AAA GTG AA－3′，104bp；Rat beta上游引物：5′－AAG AGA GGC ATC CTG ACC CT－3′；下游引物：5′－GAG CCA GGG CAG TAA TCT CC－3′，784bp。比較IL－17與Rat beta的相對吸光度值并進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以表示。采用組內(nèi)單因素方差分析和組間多重比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變 N組雙肺呈粉紅色，表面光滑，未見腫脹和出血點。B組第7天雙肺顏色灰暗，光澤差，可見散在的灶狀、片狀出血灶。第14天兩肺呈灰白色，較堅實，肺組織腫脹部分消退，表面有大小不均勻的灰白色小斑塊，觸及較硬，彈性差；第28天兩肺呈蒼白色，質(zhì)地較第14天時硬度增加，體積有所縮小，腫脹已基本消退，彈性差，表面攣縮變形，出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣，條索狀病灶。

光鏡觀察N組肺組織結(jié)構(gòu)正常。B組大鼠第7天肺泡炎明顯，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞滲出，成纖維細(xì)胞增殖。第14天，大鼠肺炎性細(xì)胞浸潤減輕，成纖維細(xì)胞增多和膠原纖維增生，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失；第28天，大鼠肺炎性細(xì)胞浸潤進(jìn)一步減輕，肺纖維化程度加重，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織呈條索樣瘢痕改變，斑片狀分布。D組病理變化與B組基本相同，不同時間點，D組炎癥細(xì)胞的浸潤和纖維細(xì)胞增生及膠原纖維的沉積要輕于B組。見圖1。

圖1 光鏡下的肺組織結(jié)構(gòu)（HE×200）

2.2 HYP在各組大鼠肺組織中含量的變化 HYP含量在N組大鼠肺組織中隨時間變化無明顯改變。HYP含量在B組和D組大鼠肺組織隨時間延長逐漸增加。B組HYP含量較N組明顯增加（P＜0.05），D組HYP含量較N組明顯增加（P＜0.05），較B組明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

2.3 肺組織中IL－17mRNA和IL－17的含量 肺組織IL－17 mRNA的表達(dá)在N組小鼠肺組織中表達(dá)較弱，而在B組小鼠肺組織第7天達(dá)到高峰，第14天略有下降，第28天明顯下降，D組較N組增加（P＜0.05），較B組減少（P＜0.05）。各時間點之間有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1、圖3）。

2.4 肺組織中IL－17的含量 B組大鼠肺組織中IL－17的含量各時間點較N組相比顯著增高，且在第7天達(dá)到高峰（P＜0.05），之后IL－17含量逐漸減少，但第28天仍高于N組（P＜0.05）。D組各時間點IL－17含量均低于B組（P＜0.05），但高于N組中的含量（P＜0.05），見圖4。

圖2 HYP在各組大鼠肺組織中水平變化

圖3 肺組織中IL－17mRNA和IL－17的水平

表1 肺組織中IL－17mRNA的表達(dá)（）

表1 肺組織中IL－17mRNA的表達(dá)（）

注：－表示無數(shù)據(jù)；與N組相比，＊P＜0.05；與B組相比，＃P＜0.05。

組別 n 第7天 第14天 第28天8 0.777±0.127 0.783±0.131 0.898±0.134 B組 8 2.481±0.358＊ 2.163±0.415＊ 1.633±0.263＊D組 8 － 1.738±0.273＊＃ 1.308±0.209＊＃N組

圖4 IL－17在肺組織中的表達(dá)

2.5 支氣管灌洗液中IL－17的水平 B組大鼠支氣管灌洗液中IL－17的水平各時間點較N組相比顯著增高，且在第7天達(dá)到高峰（P＜0.05），之后IL－17水平逐漸減少，但第28天仍高于N組（P＜0.05）。D組各時間點IL－17水平均低于B組（P＜0.05），但高于 N組中的水平（P＜0.05），見圖5。

2.6 IL－17在肺組織與支氣管灌洗液中的關(guān)系及與羥脯氨酸的關(guān)系 IL－17在肺組織中與支氣管灌洗液中呈正相關(guān)（r＝0.774，P＜0.01），與羥脯氨酸呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.831，P＜0.05）。

圖5 IL－17在支氣管沖洗液中的表達(dá)

3 討 論

IL－17是一種促炎癥性細(xì)胞因子，含有155個氨基酸的糖蛋白［2］。Th17是能分泌IL－17細(xì)胞因子的CD4＋T細(xì)胞，在人體，除了Th17細(xì)胞能分泌IL－17外，還有γδT細(xì)胞及NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞，但主要的來源還是Th17細(xì)胞［3－5］。IL－17可以促進(jìn) T 細(xì)胞的激活和刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL－6、IL－8、粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞刺激因子（GM－CSF）和化學(xué)增活素及細(xì)胞黏附分子，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。

應(yīng)用博來霉素制備肺纖維化動物模型是目前公認(rèn)最接近人肺纖維化的實驗?zāi)Ｐ停?］。肺內(nèi)膠原合成的主要細(xì)胞是肺成纖維細(xì)胞，羥脯氨酸含量可以用來反映肺內(nèi)膠原含量，因此纖維化程度可以用測定肺組織中羥脯氨酸含量來判斷。本研究采用氣管內(nèi)注入博來霉素制備大鼠肺纖維化模型，肺纖維化模型組及地塞米松組大鼠肺組織羥脯氨酸含量的測定結(jié)果隨時間逐漸升高，提示肺纖維化動物模型制備成功。本研究發(fā)現(xiàn)，IL－17在博來霉素組大鼠肺纖維化發(fā)生的早期表達(dá)升高，并于造模后第7天肺泡炎癥最重時達(dá)到峰值，進(jìn)而隨著肺纖維化的發(fā)展逐漸降低，但仍高于健康對照組。IL－17在肺組織表達(dá)規(guī)律和支氣管灌洗液中的變化趨相一致，呈現(xiàn)了先高后低的趨勢，與羥脯氨酸呈負(fù)相關(guān)。Prudhomne［7］在研究肺的囊性纖維化中，提出 Th17、IL－17與肺纖維化有關(guān)，Decraene等［8］在檢測IL－17與IL－23在肺纖維化患者痰液的mRNA表達(dá)和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)了在肺纖維化的炎癥及病理發(fā)展過程中IL－23和IL－17起著重要作用。

綜上所述，提示IL－17參與了肺纖維化的全過程，為肺纖維化的診斷及治療提供了一條新的思路。但是，肺纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，有關(guān)IL－17與肺纖維化的發(fā)病機制還需進(jìn)一步研究。

［1］Melissa M，Ahmedin J，Robert A，et al.Worldwide variations in colorectal cancer［J］.CA Cancer J Clin，2009，（59）：366－378.

［2］戴小波，孫萬邦.IL－17免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（6）：732－734.

［3］Ferretti S，Bonnean O，Dubois GR，et al.IL－17，produced by lymPhocytes and neutrophils，is necessary for lipopolysaccharide－induced airway neutrophilia：IL－15as a possible trigger［J］.J Immunol，2003，170（4）：2106－2112.

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