孫學(xué)剛，莫潔虹，2，刁建新，劉遠(yuǎn)亮，朱成全

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515;2.新會人民醫(yī)院，廣東江門 529100;3.解放軍421醫(yī)院，廣州 510308)

和胃寶是臨床用于防治消化性潰瘍的有效驗方［1］。前期的研究表明，和胃寶能夠改善消化性潰瘍上腹痛、腹脹等臨床癥狀，并顯著增加病人的潰瘍愈合率和幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)清除率［2，3］。Hp是導(dǎo)致消化性潰瘍的重要病因，Hp的持續(xù)感染易引起胃黏膜局部的炎癥反應(yīng)，對白細(xì)胞的氧化爆發(fā)有明顯的激發(fā)作用，并產(chǎn)生活性氧自由基［4］，而和胃寶能否通過改善潰瘍炎癥及氧化應(yīng)激的作用尚不清楚。本研究擬研究和胃寶對實驗性潰瘍模型環(huán)氧合酶(cyclooxygenase-2，COX-2)和誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，初步闡明和胃寶防治消化性潰瘍的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性BARB/c小鼠60只，體質(zhì)量22～24g，隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、模型組、和胃寶低、中、高劑量組和法莫替丁組，每組10只，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號 SCXK粵2006-0015)。

1.2 藥物

和胃寶主要由苦參、白芍、木瓜、烏賊骨、白及、大黃、金銀花、甘草組成，由中國人民解放軍第421醫(yī)院提供，水煎濃縮成2g生藥/ml，200目濾膜過濾除滓。法莫替丁膠囊為上海達(dá)華藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號100226)。主要試劑:iNOS一抗(sc-7271)、COX-2一抗(sc-23983)均購于美國Santa Cruz公司;血清幽門螺桿菌尿素酶抗體檢測(膠體金法)試劑盒購自北京康美醫(yī)藥科技有限公司;免疫組織化學(xué)試劑盒購于基因公司;總蛋白提取及定量試劑盒購于碧云天試劑有限公司;ECL發(fā)光液購于 Merck Millipore公司。

1.3 主要儀器

主要儀器:德國萊卡石蠟切片機(jī);日本尼康Eoipse Ti-s熒光倒置顯微鏡及分析軟件;美國Thermo全波段酶標(biāo)儀;瑞典MiniVE垂直蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng);美國柯達(dá)2000MM全光譜多功能圖像工作站。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立 Hp(NCTC 11637)1.4×109CFU感染 BARB/c小鼠，連續(xù)5次接種，1周完成［5］。感染Hp的小鼠禁食不禁水24 h后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開腹暴露胃，在胃前壁竇體交界同一部位(避開血管)，用浸有100%冰醋酸、直徑為5mm的圓形濾紙接觸1 min，然后還納胃體逐層縫合切口。

1.4.2 分組與喂藥 小鼠隨機(jī)分組后稱重、標(biāo)記。于造模后1d分別給予和胃寶高劑量3g/(kg·d)、中劑量2g/(kg·d)、低劑量1g/(kg·d)，法莫替丁10 mg/(kg·d)和等體積的0.9%生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)10 d。處死前1d禁食不禁水，麻醉后剖腹，腹主動脈取血;結(jié)扎賁門，摘取全胃，胃組織分別置于10%的甲醛和－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察內(nèi)容及方法

1.5.1 組織學(xué)檢查 甲醛固定組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、4μm切片，蘇木精-伊紅染色。顯微鏡(Nikon Eoipse Ti-s)下隨機(jī)選取5個視野，觀察炎癥細(xì)胞浸潤、黏膜層厚度及纖維排列。

1.5.2 抗幽門螺桿菌抗體 膠體金法測得血清中Hp抗體表達(dá)水平，按顏色反應(yīng)判定結(jié)果:無顏色為陰性(0級)，淺黃色至橘紅色為陽性，按深淺分為+(1級)++(2級)。

1.5.3 免疫組化檢查 切片脫蠟、水化、檸檬酸鈉抗原修復(fù)、內(nèi)源性封閉、外源性封閉后，滴加iNOS、COX-2一抗孵育，加二抗和生物素，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，每張切片隨機(jī)選取3個視野觀察并拍照。蛋白表達(dá)依據(jù)染色水平分為0(無)、1(輕度)、2(中度)和3(重度)，依據(jù)染色面積0(無)、1(≤25%)、2(＞25%≤50%)和3(＞50%)，二者相乘得到該視野表達(dá)水平。

1.5.4 蛋白質(zhì)免疫印跡 每組取胃組織樣本50mg，提取總蛋白。每樣本取50 ug行SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上(Pall公司)，5%脫脂牛奶封閉，室溫孵育1.5 h;分別加入COX-2抗體和iNOS抗體，4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，用ECL化學(xué)發(fā)光法在Kodak 2000MM圖像工作站成像。COX-2、iNOS的相對表達(dá)水平為二者的光密度值與β-actin光密度值的比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，首先應(yīng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊時應(yīng)用ANOVA法進(jìn)行檢驗，并用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較;方差不齊時應(yīng)用Welch法進(jìn)行檢驗，應(yīng)用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較;等級資料進(jìn)行k個多元獨立樣本的非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和胃寶對實驗性胃潰瘍小鼠一般情況和組織病理學(xué)的影響

模型組小鼠術(shù)后食欲下降、活動減少、四肢無力、倦臥嗜睡、被毛蓬松，和胃寶低中高劑量組顯著改善其倦怠嗜臥表現(xiàn)，中高劑量組顯著增加進(jìn)食量。圖1顯示，模型組小鼠均可見潰瘍形成，黏膜上皮損壞、脫落嚴(yán)重，見大量炎癥細(xì)胞浸潤，潰瘍床有肉芽組織形成，潰瘍周圍黏膜腺體呈囊狀擴(kuò)張，頂端向潰瘍底部傾斜，纖維排列紊亂。與模型組比較，和胃寶高、中劑量組顯著改善潰瘍損傷，表現(xiàn)為潰瘍較為表淺，黏膜層較厚，炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維排列較整齊，其中高劑量組和法莫替丁組改變較為顯著。

圖1 和胃寶對實驗性胃潰瘍小鼠組織病理學(xué)的影響

2.2 和胃寶對胃潰瘍小鼠SOD、MDA和Hp抗體水平的影響

表1顯示，模型組SOD活性顯著降低，與模型組比較，和胃寶中、高劑量組顯著提高SOD的活性(P＜0.05，P＜0.01)。模型組MDA含量降低，與模型組比較，和胃寶高劑量組和法莫替丁降低MDA水平(P＜0.05，P＜0.05)。與對照組比較，模型組Hp表達(dá)顯著增高，高劑量和法莫替丁顯著減低其表達(dá)(P＜ 0.01，P＜ 0.05)。

2.3 和胃寶對COX2、iNOS原位表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)顯示，COX-2和iNOS在潰瘍基底部的表達(dá)顯著升高，與模型組比較，和胃寶高、中劑量組顯著降低COX-2(P＜0.01，P＜0.05)表達(dá)水平。與模型組比較，法莫替丁組顯著降低COX-2表達(dá)(P＜0.05)，未顯著降低iNOS的表達(dá)(圖2-3)。

表1 和胃寶對小鼠血清SOD、MDA、Hp、COX-2和 iNOS 表達(dá)水平(±s)

表1 和胃寶對小鼠血清SOD、MDA、Hp、COX-2和 iNOS 表達(dá)水平(±s)

注:與正常組比較:△P ＜0.05，▲P ＜ 0.01;與模型組比較 :*P ＜ 0.05，#P ＜0.01

iNOS組別SOD(nmol/ml)MDA(u/ml)Hp表達(dá)平均秩次COX-2平均秩次 平均秩次對 照 組 125.70±19.75# 15.46 ±6.76# 11.90# 27.82# 61.97#模 型 組 91.81±17.98▲ 29.06 ±9.22▲ 45.40▲ 128.22▲ 107.13▲和胃寶 低 劑量 100.42±19.28▲ 26.65 ±5.89▲ 41.30▲ 114.52▲ 100.03▲和胃寶 中 劑量 110.82±18.88* 24.67 ±10.18▲ 31.50△ 101.43▲＊ 91.34△和胃 寶 高 劑 量 119.93±21.58# 21.82 ±6.44* 25.50# 75.85▲# 83.07法 莫 替 丁 102.46±15.78▲ 20.93 ±6.12* 27.40△＊ 95.17▲# 93.58△

圖2 和胃寶對胃潰瘍模型小鼠胃黏膜COX-2表達(dá)的影響(×100)

圖3 和胃寶對胃潰瘍模型小鼠胃黏膜iNOS表達(dá)的影響(×100)

2.4 和胃寶對胃潰瘍組織COX-2、iNOS蛋白表達(dá)的影響

圖4顯示，蛋白免疫印跡顯示，與對照組比較，COX-2和iNOS在模型組顯著升高(P＜0.01，P＜0.01)。與模型組比較，和胃寶高、中劑量組顯著降低 COX-2(P＜0.01，P＜0.01)表達(dá)水平，法莫替丁組顯著降低COX-2(P＜0.01)，和胃寶和法莫替丁對iNOS表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

幽門螺桿菌和非甾體抗炎藥是損害胃腸保護(hù)機(jī)制導(dǎo)致胃潰瘍發(fā)病的最常見病因，胃酸在潰瘍形成中起關(guān)鍵作用。我們應(yīng)用幽門螺桿菌感染聯(lián)合冰醋酸復(fù)合造模法形成胃潰瘍，模型組小鼠黏膜損傷至肌層、Hp抗體表達(dá)水平升高，提示模型復(fù)制成功，且與人類的胃潰瘍形成機(jī)制相似［5］。

圖4 和胃寶對胃潰瘍模型小鼠COX-2和iNOS表達(dá)的影響

胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃痛”、“吐酸”、“嘈雜”等范疇，感受外邪，損傷胃黏膜;內(nèi)傷飲食，“積滯中焦，久郁成熱，則本從火化，因而作酸”(《證治匯補·吞酸》)，二者合邪，損傷胃府，胃痛乃成?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩?“諸嘔吐酸，暴注下迫，皆屬于熱”，故和胃寶主要選用苦參、木瓜、烏賊骨、白及、大黃、金銀花、白芍、甘草清熱解毒、緩急止痛、斂瘡生肌，治療胃潰瘍每收良效。和胃寶的3個劑量組均顯著改善胃潰瘍模型黏膜損傷，高、中劑量組降低血清Hp表達(dá)水平，并呈療效劑量依賴關(guān)系，與我們此前的臨床試驗結(jié)果相一致［1，2］。

我們設(shè)計本動物實驗的目的在于克服難以取得臨床樣本和服藥依從性的問題。結(jié)果顯示，模型組SOD水平降低和MDA水平增高，顯示Hp感染和低酸等造成胃內(nèi)抗氧化劑明顯降低，誘發(fā)胃內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，N-亞硝基化合物和反應(yīng)性氧代謝產(chǎn)物(reactive oxygen metabolites，ROM)顯著增加［6］，Hp感染結(jié)合乙醇和去氧膽酸鈉的復(fù)合胃炎模型結(jié)果支持我們模型的變化趨勢［7］。臨床研究表明，Hp顯著降低胃潰瘍炎癥病人SOD含量、增加ROM含量，表明Hp引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是胃黏膜損傷的重要因素［8］。和胃寶中、高劑量組增高小鼠血清SOD活力，高劑量組降低MDA水平，表明和胃寶可能通過改善黏膜氧自由基的堆積，減少胃黏膜細(xì)胞變性、壞死，保護(hù)胃黏膜，促進(jìn)潰瘍愈合。

抑制COX-2能夠顯著降低二甲基亞硝胺誘發(fā)的肝損傷，并降低 MDA［9］，COX-2抑制劑能夠增加SOD并減少MDA水平，和胃寶通過COX-2抑制作用降低MDA、升高SOD水平。綜上，以清熱解毒為組方核心的和胃寶，可能通過調(diào)節(jié)COX-2通路，抑制Hp誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進(jìn)胃潰瘍愈合。

［1］姜希林，張玉亮，方壯生，等.和胃寶膠囊治療消化道潰瘍及根治幽門螺桿菌的臨床研究［J］.海軍醫(yī)學(xué)雜志，2002，23(1):26-27.

［2］龔峻梅，張玉亮，姜希林，等.和胃寶膠囊治療艦艇人員幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的臨床研究［J］.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2003，10(1):40-41.

［3］黃碧燕，朱成全，張玉亮，等.和胃寶顆粒劑對幽門螺桿菌和消化性潰瘍的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010(2):196-197.

［4］Malfertheiner P.The intriguing relationship of Helicobacter pylori infection and acid secretion in peptic ulcer disease and gastric cancer［J］.Dig Dis，2011，29(5):459-464.

［5］楊善民，方瑩，陳福.Hp感染實驗胃潰瘍BALB/c小鼠動物模型［J］.上海實驗動物科學(xué)，2001，21(3):154-156.

［6］Wu Z.Z.，F(xiàn)art.M.J.幽門螺桿菌相關(guān)性胃黏膜上皮細(xì)胞癌變，氧化應(yīng)激和營養(yǎng)型抗氧化劑［J］.胃腸病學(xué)，2000，5(3):146-149.

［7］姜惟，顧武軍，周春祥.半夏瀉心湯對慢性胃炎合并幽門螺桿菌感染大鼠 SOD、MDA的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2003，20(5):27-30.

［8］褚惠民，宣蓓.胃液超氧化物歧化酶及胃竇黏膜氧自由基和幽門螺桿菌關(guān)系探討［J］.上海醫(yī)學(xué)，1998，21(9):522-523.

［9］Farombi E O，Shrotriya S，Surh Y J.Kolaviron inhibits dimethyl nitrosamine-induced liver injury by suppressing COX-2 and iNOS expression via NF-kappaB and AP-1［J］.Life Sci，2009，84(5-6):149-155.