于佳寧，林海燕

(1.煙臺市牟平人民醫(yī)院，山東煙臺 264100;2.濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一種癌變率很高的疾病，尤其伴有異性增生和腸化生等病理改變者常稱其為癌前病變。如何尋找一種能有效阻斷CAG發(fā)展的方法和藥物已成為目前研究胃癌一級預防的一個熱點。課題組根據(jù)長期的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛貫穿于本病的始終，為其主要病機，胃絡瘀阻為其標，治療本病當益氣養(yǎng)陰活血為法。本課題對益氣養(yǎng)陰活血法為主組方的臨床經(jīng)驗方劑萎胃康及其拆方進行研究，旨在為益氣養(yǎng)陰活血法治療CAG提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

Wistar雄性大鼠70只，體質(zhì)量180～200g，由山東大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(魯)20090001)。

1.2 藥物

萎胃康由西洋參20g、白術15g、白芍15g、三七10g、延胡索10g、熊膽5g溶化、甘草5g組成;拆方 I號由西洋參20g、白術15g、白芍15g、甘草5g組成;拆方II號由三七10g、延胡索10g、熊膽5g溶化組成，全部藥材均經(jīng)中藥方劑學教研室鑒定符合《中國藥典》(2010版)要求。分別取上藥量1劑，常規(guī)煎煮、過濾，合并2次煎液后將熊膽溶入。在80℃恒溫水中，按照動物與人體表比換算法分別濃縮為萎胃康水煎液0.8g生藥/mL，拆方 I號水煎液0.55g生藥/mL，拆方II號水煎液0.25g生藥/mL，制備后冰箱貯存，使用時水浴加熱。維霉素糖衣片為湖北綠金子藥業(yè)有限責任公司產(chǎn)品(批號100903)，用蒸餾水制成0.03g生藥/mL的混懸液，制備后冰箱貯存。

1.3 試劑

水楊酸鈉為國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)(批號T20100125);兔抗鼠EGF一抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;兔抗鼠EGFR一抗購自武漢博士德生物工程公司;3%過氧化氫溶液、正常山羊血清工作液、生物素標記的II抗工作液、過氧化物酶-鏈霉卵白素工作液均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立

將70只Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)7d后隨機抽取12只作為正常對照組，其余為造模組。正常組正常飼養(yǎng)，造模組大鼠均結合文獻［1］采用綜合法造模，即2%水楊酸鈉溶液2mL/次，ig，連灌6周;ig前、后1h禁食、禁水。前3周自由進食標準鼠飼料、進水;后3周單日禁食，自由飲水，雙日足量喂食，自由飲水，進食后于25℃的溫水中進行游泳，每次10min。造模過程中死亡4只，造模結束后正常組隨機抽取2只，造模組隨機抽取4只處死，經(jīng)病理檢查確認模型制作成功，將造模組剩余的50只CAG大鼠隨機分為模型組、萎胃康全方組(全方組)、拆方I號組(補益組)、拆方II號組(祛邪組)和西藥維霉素糖衣片對照組(西藥組)5組，每組10只。

2.2 給藥方法

正常組和模型組均灌胃生理鹽水，全方組、補益組、祛邪組和西藥組分別灌胃萎胃康水煎液、拆方I號水煎液、拆方II號水煎液和維霉素混懸液，1mL/次/d，連續(xù)用藥30d，每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥量。

2.3 標本采集與檢測

實驗結束后，各組動物禁食不禁水24h后，5%戊巴比妥鈉按50mg·kg－1ip麻醉后，快速剖取全胃標本，沿胃大彎剪開胃體，用生理鹽水洗去胃內(nèi)容物后，取胃小彎側胃竇部0.5cm×2cm大小胃組織置于10%的甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張，切片厚 5um，分別做 HE染色，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)、表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)免疫組化SP法染色。具體染色步驟如下:切片脫蠟至水;微波進行抗原修復;PBS洗滌5min×3次，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶;PBS洗滌5min×3次，加入山羊血清封閉非特異性抗原，吸去多余血清加入一抗，4℃ 孵育過夜;PBS洗滌5min×3次，滴加生物素標記的二抗孵育20min;PBS洗滌5min×3次，加入過氧化物酶-鏈酶卵白素孵育;PBS洗滌5min×3次，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片。一抗效價均為1∶100，均以PBS代替一抗做陰性對照。

2.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.00軟件進行統(tǒng)計分析，所有資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，計量資料組間進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠胃黏膜光鏡下病理組織學改變

正常組大鼠胃黏膜上皮完整，細胞排列整齊，呈單層柱狀，腺上皮與腺管分界清楚，固有膜腺體飽滿清晰，未見萎縮脫落或缺損，胞漿透明(見圖1-①)。模型組大鼠胃黏膜層變薄，不完整，多數(shù)腺體結構排列紊亂，有不同程度的萎縮或消失，有彌漫或灶性淋巴細胞、漿細胞浸潤，細胞大小形態(tài)不一(見圖1-②)。全方組大鼠胃黏膜上皮排列規(guī)整，腺體大小形態(tài)一致。肌層逐漸增厚，厚薄較均勻(見圖1-③)。補益組黏膜病變有所恢復，上皮細胞相對完整，腺體排列稍欠規(guī)整，表層黏膜無脫落，固有膜中的炎細胞浸潤顯著減少(見圖1-④)。祛邪組和西藥組胃黏膜腺體細胞數(shù)量較模型組明顯增多，胃黏膜結構紊亂程度較模型組輕(見圖1-⑤、1-⑥)。

圖1 各組大鼠胃黏膜光鏡下病理表現(xiàn)比較(HE，×100)

圖2 萎胃康及其拆方對CAG大鼠胃黏膜EGF表達的影響

圖3 萎胃康及其拆方對CAG大鼠胃黏膜EGFR表達的影響

3.2 各組大鼠胃黏膜EGF、EGFR的表達

EGF染色的陽性部位主要出現(xiàn)在細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色(圖 2-①、2-②、2-③)。EGFR 染色陽性部位也主要在細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色(圖3-①、3-②、3-③)。表 1 顯示，各組胃竇黏膜 EGF、EGFR表達的比較。

4 討論

近年來，表皮生長因子(EGF)與胃黏膜疾病的關系成為研究的熱點。有人發(fā)現(xiàn)EGF在胃癌和中重度萎縮性胃炎患者的胃黏膜中表達增強，提出EGF可能參與CAG癌變的觀點［2］。認為EGF的正常表達可引起胃黏膜增殖，對CAG患者胃黏膜病變的愈合具有重要作用。一旦表達過度，就會使細胞異常增生，異常增生的細胞容易發(fā)生變異，并有逐步惡性表型轉化的趨勢，使細胞密度相關抑制活性消失、代謝增強，促進某些病毒和化學物質(zhì)的致癌作用［3］。

表1 萎胃康及其拆方對CAG大鼠胃黏膜EGF、EGFR表達的影響(±s，n=10，×10－2)

表1 萎胃康及其拆方對CAG大鼠胃黏膜EGF、EGFR表達的影響(±s，n=10，×10－2)

注:與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與全方組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;與補益組比較:5)P＜0.01，6)P＜0.05

組 別 劑量/g·mL －1 EGF平均光密度EGFR平均光密度正常組 —11.78±2.18 12.34±1.37模型組 — 18.27±1.431) 20.49±1.311)全方組 0.80 12.27±2.562) 14.44±0.862)補益組 0.55 13.36±2.132) 15.75 ±1.322，4)祛邪組 0.25 13.68 ±0.972) 17.29 ± 1.382，3，5)西藥組 0.03 15.15 ± 1.502，3，6) 16.89 ± 1.252，3，5)

表皮生長因子受體屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶，對EGF具有高度親和性，是癌基因c-erbB-1的表達產(chǎn)物。在胃癌、頭頸癌、前列腺癌等在內(nèi)的多數(shù)惡性腫瘤上皮有高表達，與腫瘤的進展、血管生成、轉移擴散等均密切關系。其與EGF結合后，能引起自身磷酸化和細胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，激活酪氨酸激酶，繼而促發(fā)細胞分裂信號，引起細胞分裂。而此種過度增生的細胞易發(fā)生變異并可逐步向惡性表型轉化。EGFR不同程度的表達，可能調(diào)節(jié)和刺激細胞增殖，促進有絲分裂并向癌發(fā)展［4］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組EGF、EGFR表達水平明顯高于正常組，這與國內(nèi)報道在人群中的表達情況是一致的［5］?？赡苁侵履＿^程刺激下使內(nèi)源性EGF分泌增加、受體激活，通過其修復、增殖作用，來保護胃黏膜抵御各種致炎因子的侵襲，以利于胃黏膜再生修復。提示在實驗刺激控制下的CAG大鼠有反應性EGF、EGFR表達升高，EGF、EGFR可能參與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生、轉化過程。經(jīng)各中藥和維酶素治療后，EGF、EGFR表達明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，以全方組效果最好，其次是補益組。

分析萎胃康及其拆方治療CAG的機制可能是:一方面誘導、促進細胞的分化成熟。經(jīng)H-E染色、光鏡觀察我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后胃黏膜萎縮、腸化與模型組比較均顯著下降，提示可能與誘導和促進腸化細胞、異型增生細胞的分化成熟，阻止其發(fā)生癌變或使其逆轉為正常有關;另一方面抑制細胞的異常增殖，從而有利于黏膜細胞的更新及損傷后的修復，調(diào)節(jié)胃黏膜細胞增殖水平恢復正常，其確切的機制尚有待進一步的研究。

［1］張淑芹，趙林山，鄭繼奎，等.慢性萎縮性胃炎動物模型的復制［J］.哈爾濱師范大學自然科學學報，2001，17(6):81-83.

［2］吳加國，姚健敏，曹倩，等.表皮生長因子對SD大鼠萎縮性胃炎的作用［J］.中華內(nèi)科雜志，2001，40(3):169-172.

［3］袁紅霞，趙強，黃文政，等.善胃方對氣陰兩虛型胃癌前期病變 EGF 及 EGFR 的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2004，21(1):9-12.

［4］劉正新，陳寶雯，楊桂彬，等.不同胃黏膜病變的細胞增殖變化規(guī)律及其意義［J］.中華內(nèi)科雜志，2004，43(8):580-583.

［5］曹京旭，孔可，蘇久蓮，等.慢性萎縮性胃炎患者血清TNF、IL-2及hEGF含量測定及臨床意義［J］.沈陽部隊醫(yī)藥，1997，10(5):413-414.