周躍華，殷東風(fēng)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032)

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，全世界每年新發(fā)病例100萬(wàn)，死亡約60萬(wàn)例［1］，是臨床研究的熱點(diǎn)之一。而乳腺癌動(dòng)物模型是研究乳腺癌生物學(xué)行為及指導(dǎo)臨床治療的重要工具之一。因此，本研究的目的是建立人乳腺癌細(xì)胞移植模型，為研究乳腺癌打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

BALB/C-nu/nu雌性 SPF級(jí)裸小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量17～22g，共22只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào) SCXK(滬)2007-0005)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)條件下。

1.2 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心ATCC，ER陽(yáng)性)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。

1.3 試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)液(HyClone美國(guó));特級(jí)胎牛血清(天津?yàn)笊镏破?;4%多聚甲醛;雌激素受體(ER)免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒均購(gòu)于北京中山生物工程公司;骨髓穿刺針;NIKON光學(xué)顯微鏡(ALPHAPOT-2 YS2)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于含有10%血清，1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.5 動(dòng)物造模

1.5.1 瘤細(xì)胞懸液接種原代腫瘤 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶/EDTA消化，用細(xì)胞培養(yǎng)液配置成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞要吹打均勻;臺(tái)盼藍(lán)染色，記錄活細(xì)胞數(shù)(＞95%);計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107/ml;于每只裸鼠右側(cè)胸壁消毒，取1ml注射器抽取瘤細(xì)胞懸液0.1ml，接種于裸鼠右側(cè)胸壁第二乳墊下［2］，共接種2只，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況［3］。

1.5.2 骨髓穿刺針行瘤組織移植 當(dāng)原代腫瘤長(zhǎng)至0.8cm3大小時(shí)，手術(shù)取下腫瘤(圖1)，使用骨髓穿刺針?lè)謩e移植至余20只裸小鼠乳墊下:10%水合氯醛(0.02ml/10g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉荷瘤裸鼠，無(wú)菌條件下取出乳腺癌組織立即放入DMEM培養(yǎng)液中(圖2)，剪切成1mm3左右的小塊，置入骨髓穿刺針中備用。接種前，用碘伏消毒健康裸鼠的右側(cè)胸壁，于右側(cè)胸壁第二乳墊旁開(kāi)1cm平刺進(jìn)針，進(jìn)至乳墊下時(shí)插入針芯，將瘤組織留在乳墊下，皮膚消毒，不需要縫合傷口，腹腔一次性注射青霉素1.5萬(wàn)U，裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級(jí)箱中。

1.6 術(shù)后觀察

觀察術(shù)后裸鼠傷口愈合情況、死亡情況，隔天測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)情況并記錄。第30天拉頸處死荷瘤鼠，剝離腫塊行病理學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè)ER的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般狀態(tài)

術(shù)后約1～2h裸鼠全部蘇醒，術(shù)后24h傷口愈合，飲食及活動(dòng)正常，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束裸鼠無(wú)死亡。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)情況

接種乳腺癌細(xì)胞后的第12天，在接種部位乳墊處可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，呈圓形、橢圓形，觸之質(zhì)地較硬，后結(jié)節(jié)逐漸增大，越長(zhǎng)越快，約在第20天行穿刺針瘤組織原位移植，移植后第4～5天后乳墊處即可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，成瘤率100%，且形狀、大小較整齊。在移植后第20天腫瘤長(zhǎng)至9±2mm(圖3)，腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)就會(huì)侵及皮膚，出現(xiàn)潰瘍性壞死。

圖1 手術(shù)剝離腫瘤

圖2 培養(yǎng)液中的瘤組織

圖3 穿刺針成功移植的腫瘤

2.3 病理學(xué)檢查

剝離的移植瘤呈圓形、橢圓形或分葉狀，多侵犯皮膚，其血管豐富，多見(jiàn)腫瘤潰瘍性壞死，有的與皮膚黏連難以剝離，無(wú)淋巴結(jié)及其他臟器轉(zhuǎn)移。腫塊質(zhì)地中等，剖面為蒼白色、半透明、質(zhì)實(shí)的實(shí)性區(qū)，腫瘤大者中心呈灰白色，有壞死現(xiàn)象。HE染色后光鏡觀察，腫瘤細(xì)胞大、生長(zhǎng)旺盛，腫瘤細(xì)胞密集、排列呈團(tuán)索樣結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)豐富、核大、核仁清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相明顯，可見(jiàn)散在壞死灶，病理診斷為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。

2.4 ER的檢測(cè)結(jié)果

免疫組化(IHC)檢測(cè)嚴(yán)格按照按試劑盒要求操作，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，結(jié)果20只裸鼠原位移植瘤組織的檢測(cè)均為陽(yáng)性表達(dá)。

3 討論

乳腺癌動(dòng)物模型的建立是研究人乳腺癌的生物學(xué)特性的基礎(chǔ)，對(duì)乳腺癌的臨床治療治療具有重要指導(dǎo)意義。目前乳腺癌的研究主要分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更接近臨床，更真實(shí)地反映了體內(nèi)治療效果，在臨床應(yīng)用上更有參考價(jià)值。因此，建立適當(dāng)?shù)娜巳橄侔﹦?dòng)物模型，是研究人乳腺癌的生物學(xué)特性及臨床治療所必需的途徑。

本文所選用的動(dòng)物為裸小鼠，無(wú)胸腺，先天性T細(xì)胞免疫系統(tǒng)缺陷，缺乏免疫排斥反應(yīng)，腫瘤移植后生長(zhǎng)良好，并能保持腫瘤細(xì)胞的原有形態(tài)及生物學(xué)特性，是腫瘤研究中較為理想動(dòng)物［4］。目前，人乳腺癌動(dòng)物模型主要是采用瘤細(xì)胞懸液注射的方法，使用瘤組織小塊手術(shù)接種的也有報(bào)道。本研究主要是使用骨髓穿刺針原位移植瘤組織小塊造模，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)類似報(bào)道。其優(yōu)勢(shì)在于:首先一次性可大批造模，移植后腫瘤的形狀、大小較整齊，使實(shí)驗(yàn)研究更具可靠性;其次操作簡(jiǎn)單安全，成功率高達(dá)，成瘤時(shí)間短、重復(fù)性好;再次不需要大量瘤細(xì)胞懸液，節(jié)約費(fèi)用。瘤組織行病理學(xué)檢查診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，ER均為陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明移植后的腫瘤細(xì)胞保持了人乳腺癌腫瘤的組織形態(tài)和免疫學(xué)特點(diǎn)，為臨床治療及療效判斷提供了良好的動(dòng)物模型。

［1］Smigal C，Jemal A，Ward E，et al.Trends in breast cancer by race and ethnicity:update 2006［J］.CA Cancer J Clin，2006，56(3):168-183.

［2］甄林林，武正炎，范萍，等.人乳腺癌裸鼠移植模型的建立［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(6):509-510.

［3］Li Zhihong，Huang Xinfu， Li Jiyou， et al. Humanbreast carcinoma xenograftsin nude mice［J］. Chinese Medical Journal，2002，115(2):222-226.

［4］伍細(xì)丕，錢(qián)林法.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與腫瘤研究［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2000:78-83.