屈志鋼 楊超 左燕紅 黃麗娟 王鵬 趙鳳云 劉運江

在我國乳腺癌發(fā)病率以每年3%的速度遞增，且發(fā)病年齡趨向年輕化。盡管目前乳腺癌的綜合治療顯著改善了患者的生存期，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險仍然很高。目前干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤中只要一小部分具有干細(xì)胞表型的腫瘤細(xì)胞移植后，就能夠重新形成腫瘤，并且具有自我更新、形成不同分化程度的腫瘤的能力，腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞的存在及數(shù)量是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源［1］。但乳腺癌干細(xì)胞一直缺乏有效的鑒別和分離方法，我們參照Xu等［2］的實驗，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測乳腺癌組織中的CD55hig的細(xì)胞比例來代替乳腺癌類干細(xì)胞，用以判斷患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)的風(fēng)險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2008年2月至2009年1月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外一科診治的原發(fā)性乳腺癌患者45例，均為女性，年齡30～72歲，中位年齡46歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(2002版)腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例;根據(jù)腋淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移分為：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1～3枚16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥4枚13例;按乳腺腫瘤病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)：浸潤性導(dǎo)管癌33例，浸潤性小葉癌7例，其他類型乳腺癌5例;根據(jù)C-erbB2表達(dá)情況分為：陽性(++～+++)患者33例，陰性(-～+)患者12例;根據(jù)ER表達(dá)情況分為：陽性(+～+++)患者30例，陰性(-)患者15例;根據(jù)PR表達(dá)情況分為：陽性(+～+++)患者26例，陰性(-)患者19例;根據(jù)Ki67蛋白的表達(dá)情況分為：陽性(+～+++)患者32例，陰性(-)患者13例。選取病例中，8例曾行新輔助化療(化療方案為CEF方案或AC方案，化療周期為2～4個周期)，其余均為首次就診、未經(jīng)過任何治療的患者。研究對象的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、病理學(xué)指標(biāo)根據(jù)我院組織活檢和手術(shù)標(biāo)本的病理報告確定，患者的臨床資料來自住院病歷。

1.2 實驗方法 主要儀器、主要試劑及試劑配制 見表1。

表1 主要儀器、主要試劑及試劑配制

1.3 實驗步驟

1.3.1 單細(xì)胞混懸液的制備：于手術(shù)中按無菌原則切取部分乳腺癌腫塊，同時切取部分遠(yuǎn)離癌灶5 cm的乳腺組織作為CK19，CD55免疫熒光標(biāo)記時的陰性對照，低溫保存，快速到實驗室處理。分別將保存的新鮮腫瘤組織及正常乳腺組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用搓網(wǎng)法將組織搓完，將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液后以1 000 r/min離心沉淀2 min，加入PBS 10 ml洗滌1次，棄上清，再加入PBS10 ml洗滌1次，棄上清。

1.3.2 細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記：取乳腺癌組織單細(xì)胞混懸液及正常乳腺組織單細(xì)胞混懸液各1×106/ml，同時加入鼠抗人CD55-FITC原液、鼠抗人CK19-PE原液各20μl，避光、室溫孵育30 min。加入適量PBS緩沖液以1 000 r/min離心沉淀2 min。上機(jī)檢測前加入經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后的PBS 0.1 ml。將乳腺癌組織及對照組織混懸液以鼠抗人CD55、鼠抗人CK19工作液(兩種不同的熒光顯色標(biāo)記)進(jìn)行雙標(biāo)，然后采用流式細(xì)胞術(shù)方法進(jìn)行上機(jī)檢測，其中遠(yuǎn)離癌組織5 cm的乳腺組織的單細(xì)胞懸液設(shè)為陰性對照。用流式細(xì)胞儀測定乳腺癌腫瘤細(xì)胞表面CD55表達(dá)：選擇氬離子激光激發(fā)，激發(fā)波長為488 nm，測定中以前向角散射(FSC)對側(cè)向角散射(SSC)設(shè)門，調(diào)整電壓及增效，圈出CK19+、CD55hig細(xì)胞群。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 本研究參照Xu等［2］的研究方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，采用乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231進(jìn)行CD55檢測，檢測中以癌細(xì)胞表面受體大量結(jié)合CD55抗體的主峰處的熒光密度值為界值，超出此界值即定義為CD55hig，以此為界值設(shè)門分析，避免非上皮細(xì)胞的干擾，獲取門內(nèi)細(xì)胞個數(shù)。實驗結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行分析，得到CK19+、CD55hig熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示。兩個樣本均數(shù)的比較應(yīng)用Wilcoxon符號秩檢驗(散點圖中樣本成偏態(tài)分布)，3組樣本均數(shù)的差別比較應(yīng)用Kruskal-Waillis H檢驗(散點圖中樣本成方差不齊)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD55hig水平比較 乳腺癌腫瘤組織中CD55hig的細(xì)胞群比例均數(shù)為(0.21±0.20)%，較乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231所測CD55hig的比例(0.36±0.22)%低。

2.2 CD55hig細(xì)胞比例在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間比較 CD55hig的細(xì)胞比例在腋淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，1～3個腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和≥4個腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.86，P=0.000)。CD55hig細(xì)胞群比例在腋淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組、在1～3個腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、≥4個腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 CD55hig群細(xì)胞的比例在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同組間的比較%，±s

表2 CD55hig群細(xì)胞的比例在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同組間的比較%，±s

注：(1)：(2)，P=0.000;(1)：(3)，P=0.000;(2)：(3)，P=0.019

≥4枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(3)(n=13)0.390±0.069

2.3 不同C-erbB2時CD55hig細(xì)胞群比例表達(dá) 乳腺癌組織中C-erbB2(++～+++)組的CD55hig的細(xì)胞群比例(0.277±0.034)%，較 C-erbB2(-～+)組的 CD55hig的細(xì)胞群比例(0.028±0.005)%有明顯的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。見表3。

表3 CD55hig群細(xì)胞的比例在不同C-erbB2表達(dá)組間的比較%，±s

表3 CD55hig群細(xì)胞的比例在不同C-erbB2表達(dá)組間的比較%，±s

++～+++(n=33)0.277±0.034

2.4 CD55hig群細(xì)胞不同分期及 ER、PR、Ki67中的表達(dá)CD55hig的細(xì)胞比例在乳腺癌不同病理類型之間、不同臨床分期之間、ER(-)，ER(+ ～ +++)組之間、PR(-)，PR(+ ～ +++)組之間、Ki67(-)，Ki67(+～+++)組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，CD55hig細(xì)胞群的比例在術(shù)前化療與未化療比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表4、5。

3 討論

3.1 乳腺癌類干細(xì)胞的分離鑒別依據(jù) 最近越來越多的證據(jù)顯示腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞存在著等級性，即不同分化階段的細(xì)胞，其中一部分腫瘤細(xì)胞在啟動腫瘤形成和維持腫瘤生長中起決定性作用，其作用與正常干細(xì)胞相似，被命名為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSC)［1］，或稱為腫瘤類干細(xì)胞(cancer stem-like cells，CSLC)。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中亦存在類干細(xì)胞，稱之為乳腺癌類干細(xì)胞(mammary cancer stem-like cell，MCSC)。它具有永遠(yuǎn)增殖和自我更新能力，可能為乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根本原因［3］，而且它還具有逃避免疫監(jiān)視，躲避化療藥物殺傷的特性［4-6］，目前研究認(rèn)為乳腺癌組織中類干細(xì)胞的含量越高，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)會越大，預(yù)后越差［7，8］。由此可見，通過測定乳腺癌中的類干細(xì)胞含量可以反映腫瘤組織的生長情況：當(dāng)CSLC的比例很高時，機(jī)體對其失去了正常的調(diào)控能力，此時患者可能處于腫瘤進(jìn)展及向外播散轉(zhuǎn)移期;而當(dāng)其比例很低時，腫瘤組織處于穩(wěn)定生長狀態(tài)或已被當(dāng)前治療所控制。因此測定CSLC的含量可以幫助我們判斷病情和估計預(yù)后。

表4 CD55hig群細(xì)胞的比例在不同臨床分期、不同病理類型、不同ER、PR、Ki67表達(dá)組間的比較

表5 化療與未化療患者CD55hig表達(dá)比較%，±s

表5 化療與未化療患者CD55hig表達(dá)比較%，±s

未化療(n=37)0.209±0.035

一直以來乳腺癌類干細(xì)胞缺乏有效的鑒別和分離方法。2002年，Clarke等［9］首次成功地從乳腺癌細(xì)胞中分離出干細(xì)胞，2003年Al-Hajj等［10］從乳腺癌患者組織中分離出CD44+CD24-/low群細(xì)胞，經(jīng)檢測CD44+CD24-/lowESA+lin-群細(xì)胞致瘤性提高了50倍，說明了其具有不同于其他腫瘤細(xì)胞的生命力。2004年 Kondo等［11］用 Hoechst33342染料排斥法檢出MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中側(cè)亞群(side population，SP)細(xì)胞。而干細(xì)胞理論認(rèn)為干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞因帶有ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白而具有能將染料泵出表現(xiàn)為染料暗淡的特征，用Hoechst33342染料分選出來的染色暗淡的細(xì)胞被稱為SP細(xì)胞，產(chǎn)生SP表型的主要原因是因為高表達(dá)ABCG2［12］。其他不能將染料泵出的細(xì)胞被稱之為MP細(xì)胞，通過此方法分離出干細(xì)胞。2005年P(guān)atrawala等［13］改進(jìn)了這種分離方法，使用Coulter Epics流式細(xì)胞儀將SP與MP分為獨立的兩群，經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)MCF-7中SP比例為0.2%。

2007年 Xu等［2］從乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7中分離出CD55hig、CD55low兩部分，分別落在 SP、MP 部分，當(dāng) CD55hig群細(xì)胞隨培養(yǎng)基耗盡而消失后，SP細(xì)胞亦隨之消失，提示采用CD55抗體可以替代 Hoechst33342染料排斥法。隨后 Xu等［2］將CD55hig群細(xì)胞和CD55low群細(xì)胞分別培養(yǎng)，經(jīng)觀測，CD55hig群細(xì)胞生長良好，并且可以培養(yǎng)出CD55hig和CD55low兩群細(xì)胞，具有同MCF-7相近的細(xì)胞特點，而CD55low群細(xì)胞則不能;他們又將CD55hig群細(xì)胞和CD55low群細(xì)胞用錐蟲藍(lán)染色，觀察細(xì)胞凋亡情況：當(dāng)12 h血清耗盡后生存下來的 CD55hig群細(xì)胞遠(yuǎn)較CD55low群細(xì)胞多，提示CD55hig群細(xì)胞生存能力強(qiáng)，具有抵制因血清耗盡而引發(fā)的細(xì)胞凋亡能力;他們又采用神經(jīng)酰胺來檢測(神經(jīng)酰胺是一種可引起細(xì)胞凋亡的藥品)，加入神經(jīng)酰胺后24、48、72 h 后，CD55hig群細(xì)胞遠(yuǎn)較 CD55low群細(xì)胞多，提示CD55hig群細(xì)胞比CD55low群細(xì)胞生存能力更強(qiáng);同樣的試驗在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中也得到驗證。其后的克隆形成實驗亦顯示CD55hig群細(xì)胞的克隆形成效率高于CD55low群細(xì)胞，而且CD55hig群細(xì)胞還具有進(jìn)一步分化的能力，因此認(rèn)為CD55hig群細(xì)胞可能是一群具有腫瘤類干細(xì)胞樣性質(zhì)的細(xì)胞。因此我們可以通過檢測乳腺癌患者腫瘤中的CD55hig的比例來檢測乳腺癌類干細(xì)胞的含量。

CD55是一種促衰變因子(decay accelerating factor，DAF)，其生物學(xué)活性及生理功能證實可保護(hù)宿主細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解破壞［14］。即腫瘤的免疫逃逸現(xiàn)象。有研究表明，CD55與腫瘤細(xì)胞的活動度、新生血管形成、細(xì)胞凋亡的解救、腫瘤的致瘤性、腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移等有關(guān)［15］。

3.2 原發(fā)性乳腺癌組織中的類干細(xì)胞比例的測定及其臨床意義 盡管多項試驗認(rèn)為CD55hig可以成為乳腺癌類干細(xì)胞的標(biāo)記物，但CD55存在于各種血細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞上，表達(dá)不具備特異性，所以本試驗需要濾去乳腺癌組織中其他非上皮細(xì)胞，僅留下乳腺上皮細(xì)胞，以篩選CD55hig群細(xì)胞。因此我們采用了CK19+作為篩選標(biāo)記物。

CK19是一種細(xì)胞角蛋白，對乳腺上皮組織具有高度的組織特異性，因為乳腺癌病理類型中大部分為導(dǎo)管上皮來源，所以在乳腺癌中廣泛表達(dá)，近年來的試驗也證明CK19是檢測乳腺癌微轉(zhuǎn)移最有價值的標(biāo)志物之一［16，17］。

本試驗采用CD55，CK19+雙標(biāo)(熒光標(biāo)記顏色不同)，在CK19+篩選過的乳腺上皮細(xì)胞中，選取其中的CD55hig(詳見判定標(biāo)準(zhǔn))群細(xì)胞作為乳腺癌類干細(xì)胞并測算其比例，從而為乳腺癌患者的病情判斷提供理論依據(jù)。

研究結(jié)果顯示，CD55hig在腋淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組，1～3個腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及≥4個腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)：隨著腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量增多CD55hig有明顯上升趨勢，即隨腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量增多乳腺癌類干細(xì)胞的數(shù)量也增多。而乳腺癌類干細(xì)胞的多少控制著乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，因此認(rèn)為，CD55hig的細(xì)胞比例與乳腺癌灶的轉(zhuǎn)移和病情的進(jìn)展有關(guān)，該實驗中CD55hig的細(xì)胞比例的升高可以間接反映患者癌灶具有更強(qiáng)的向周圍侵襲性和轉(zhuǎn)移性，CD55hig的比例的升高間接反映患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加。

乳腺癌腫瘤組織中C-erbB2(++～+++)組的CD55hig群細(xì)胞的比例較C-erbB2(-～+)組的CD55hig群細(xì)胞的比例有明顯上升，這與C-erbB2在乳腺癌組織中的表達(dá)具有相似性。HER-2/neu基因作為乳腺癌的一種判斷預(yù)后的獨立生物學(xué)指標(biāo)，與乳腺癌的侵襲性有關(guān)，它的表達(dá)影響著乳腺癌的預(yù)后，目前研究顯示，HER-2/neu高表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率高，生存率低［18］。而本試驗中CD55hig群細(xì)胞的比例升高意味著乳腺癌類干細(xì)胞的增加，預(yù)示著患者的腫瘤具有更強(qiáng)的惡性生長和轉(zhuǎn)移的傾向，而且由于腫瘤類干細(xì)胞本身具有免疫逃逸和躲避化療藥物殺傷的特性，CD55hig組織也像C-erbB2(+～+++)的乳腺腫瘤組織一樣對化療具有抵抗性。

通過上述試驗結(jié)論認(rèn)為，檢測乳腺癌患者腫瘤中CD55hig的細(xì)胞比例可以測定出乳腺癌類干細(xì)胞的含量，對判斷乳腺癌患者的預(yù)后和病情的進(jìn)展具有重要參考價值，即CD55hig的細(xì)胞比例升高可能預(yù)示著乳腺癌惡性程度高，預(yù)后差即具有高度轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險的一個慎重預(yù)后指標(biāo)。但乳腺癌類干細(xì)胞的標(biāo)志物的認(rèn)定目前尚未達(dá)成共識，故本試驗仍處于探索階段，有待于擴(kuò)大樣本量且增加對比指標(biāo)及對患者的長期隨訪以進(jìn)一步證實。

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