畢海濤 喬曉溫 史為博 賈景娜 王杰 李英敏

孤兒核受體神經(jīng)生長誘導(dǎo)基因B-β(nerve growth factor-induced gene B-β，NGFIB-β)是孤兒核受體家族中的一員［1］，因缺乏與配體相互結(jié)合的能力又稱為非配體依賴性受體。NGFIB-β主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與中腦的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的分化有密切關(guān)系［2］。敲除NGFIB-β基因的小鼠在生后24 h內(nèi)很快死亡，并有黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的缺失，表明NGFIB-β是中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化、遷移、成熟及存活重要的調(diào)控因子［3］。Zetterstrom 等［4］通過原位雜交報(bào)道了成熟小鼠及胚胎NGFIB-βmRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)，但在中腦以外非典型多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞區(qū)域大腦皮層發(fā)育過程中NGFIB-β的蛋白表達(dá)狀態(tài)及與神經(jīng)細(xì)胞分化成熟的相關(guān)關(guān)系未見報(bào)道，本研究使用NGFIB-β小鼠單克隆抗體，采用免疫組化染色，觀察了大鼠大腦皮層發(fā)育過程中NGFIB-β蛋白表達(dá)的動態(tài)變化及與細(xì)胞分化成熟的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)采用Wistar大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級，動物合格證號：1003045，在河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。大鼠在乙醚吸入深麻醉狀態(tài)下，頸椎脫髓處死。成熟大鼠5只、孕12～19 d妊娠大鼠(每天5只)、生后1～15 d的幼鼠(選擇不同孕鼠出生后的個(gè)體每天5只)，處死后立刻取出大腦皮層組織。

1.2 試劑 小鼠抗人抗大鼠NGFIB-β單克隆抗體購自英國abcam公司;免疫組化二步法試劑(LDP，labelled dextran polymer)購自北京中杉生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 組織經(jīng)10%的中性甲醛溶液固定后，各級濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。免疫組化采用LDP法，首先用L-Lysine處理玻片，連續(xù)石蠟切片(4μm)，60℃烘干1 h，常規(guī)脫蠟、水化組織切片，微波抗原修復(fù)98℃，15 min(將切片置于0.01 mol/L pH值6.0的檸檬酸緩沖液中)，自然冷卻至室溫;切片用蒸餾水洗3 min×1，PBS洗3 min×2;3%H2O2處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3 min×3;滴加NGFIB-β單克隆抗體(1∶150)，濕盒內(nèi)4℃過夜;PBS洗3 min×3，滴加 LDP孵育 30 min，PBS洗 3 min×3;DAB顯色 5～10 min，水洗后，蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦皮層發(fā)育過程中NGFIB-β表達(dá)呈顯著動態(tài)變化首先在孕16 d觀察到正在發(fā)育中的大腦皮層有少量陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞主要位于大腦皮層的第Ⅴ、第Ⅵ層(圖1a);孕18有陽性細(xì)胞有增多趨勢(圖1b);生后1～5 d的表達(dá)達(dá)到高峰且Ⅱ～Ⅵ層均可見多量陽性細(xì)胞(圖1c，1d)，生后7之后隨著細(xì)胞的成熟陽性細(xì)胞又逐漸減少，生后13陽性細(xì)胞明顯減少，主要集中在Ⅴ～Ⅵ層(圖1e);生后36(成熟)僅在Ⅴ～Ⅵ層見個(gè)別陽性細(xì)胞(圖1f)。

2.2 NGFIB-β的陽性結(jié)果判定 陽性細(xì)胞為棕黃色(細(xì)胞核內(nèi)表達(dá))。用普通光學(xué)顯微鏡在大腦皮層隨機(jī)選擇5個(gè)高倍(×400倍)視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，最后取平均值，0：(-)＜10%：(±);＞10%：(+);＞25%：(++);＞50%：(+++)(表1)。

圖1 大鼠大腦皮層發(fā)育過程中NGFIB-β的表達(dá)(免疫組化×400)

表1 NGFIB-β在大鼠大腦皮層發(fā)育過程中的表達(dá)

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞不能進(jìn)行正常分化時(shí)，會導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常，引發(fā)多種疾病。原發(fā)性智障［5］、原發(fā)性癲癇［6］等疾病就是因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞分化遷移異常而造成的。NGFIB-β是細(xì)胞內(nèi)核受體家族中的一員，Torii等［7］發(fā)現(xiàn)，人類 NGFIB-β基因定位于2q22-23區(qū)帶上，長約8.3 kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。NGFIB-β廣泛表達(dá)于腦組織不同部位的神經(jīng)細(xì)胞中［8］，敲除NG FIB-β基因的小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞在E15.5出現(xiàn)了分化及分布的異常，出生后小鼠活動能力低下，生后24 h內(nèi)即告死亡，免疫組化技術(shù)表明小鼠黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)均無多巴胺能神經(jīng)元酪氨酸羥化酶和芳香族氨基酸脫羧酶基因表達(dá)，也無多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生，多巴胺能前體細(xì)胞不能遷移到其正常定居部位，難以與靶目標(biāo)建立有效的突觸連接，神經(jīng)細(xì)胞凋亡也明顯增加。

迄今為止的研究已證明NGFIB-β在中腦黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化、遷移、成熟和生存等方面有重要作用［9，10］但中腦以外非典型多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞區(qū)域蛋白表達(dá)狀態(tài)及意義未見報(bào)道，大腦皮層屬于非典型多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞區(qū)域，本研究采用免疫組化觀察了大鼠發(fā)育過程中大腦皮層NGFIB-β蛋白表達(dá)的動態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在大鼠大腦皮層發(fā)育過程中NGFIB-β的表達(dá)呈現(xiàn)了一個(gè)較為短暫的顯著的動態(tài)變化，NGFIB-β首先在E 16 d大腦皮層的深部(第Ⅴ、Ⅵ層)出現(xiàn)少量表達(dá)，之后隨著發(fā)育的進(jìn)行陽性表達(dá)明顯增多，生后1～5 d的表達(dá)達(dá)到高峰且Ⅱ～Ⅵ層均可見多量陽性細(xì)胞，P7之后隨著細(xì)胞的成熟陽性細(xì)胞又逐漸減少，P13時(shí)陽性表達(dá)主要集中在Ⅴ～Ⅵ層，成熟的大腦皮層僅在Ⅴ～Ⅵ層見個(gè)別陽性細(xì)胞，這種表達(dá)呈明顯的時(shí)間和空間特點(diǎn)，而且NGFIB-β陽性細(xì)胞顯示已分化的形態(tài)，隨著細(xì)胞的分化成熟陽性表達(dá)明顯減少，而且大腦皮層組織屬于非典型多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞區(qū)域，可以肯定的說這些陽性細(xì)胞并不是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，本研究提示NGFIB-β在中腦以外非典型多巴胺能區(qū)域的大腦皮層組織神經(jīng)細(xì)胞的分化遷移至成熟過程中擔(dān)當(dāng)角色。

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