王力玄，任 錦，吳艷峰，周佳瑩＊

（1．吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院09級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，吉林 長春130021；2．吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春130041）

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全身化療是目前大多數(shù)肺癌患者的主要治療手段。但是，多藥耐藥（MDR）嚴(yán)重影響化療效果及預(yù)后，是臨床亟待解決的問題［1］。因此，深入了解肺癌的耐藥機(jī)制，嘗試新的方法以防止或逆轉(zhuǎn)耐藥性，對(duì)提高肺癌的治療效果及患者生存率有重要意義。本研究應(yīng)用超抗原葡萄球菌腸毒素A（SEA）觀察其對(duì)人肺巨細(xì)胞癌株（PLA801D）細(xì)胞的生物學(xué)行為，旨在為人肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 PLA801D細(xì)胞株由北京解放軍總醫(yī)院提供，SEA由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所提供，噻唑藍(lán)（MTT）試劑，RPMI 1640培養(yǎng)基為美國sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1．2 方法

1．2．1 MTT比色法 取對(duì)數(shù)生長期的PLA801D細(xì)胞，0．25%胰蛋白酶消化，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105／ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔100μl，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時(shí)，分組，0ng／ml組、20ng／ml組、40ng／ml組和80ng／ml組，每個(gè)濃度10復(fù)孔，靜止培養(yǎng)24h，于結(jié)束前6h加入MTT試劑20nl／孔，終濃度為500mg／L繼續(xù)培養(yǎng)6h后，棄上清，每孔內(nèi)加入DMSO（二甲基亞砜）150nl，振蕩5min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算PLA801D細(xì)胞增殖抑制率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

PLA801D細(xì)胞抑制率＝（1－加藥組細(xì)胞A值÷對(duì)照組細(xì)胞A值）×100%

1．2．2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1．2．1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25毫升培養(yǎng)瓶進(jìn)行，每個(gè)濃度3瓶，培養(yǎng)結(jié)束后用0．25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞PBS洗二次，70%冷乙醇固定，4℃內(nèi)保存，上機(jī)前過40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106／ml，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞周期結(jié)果以 Modiff 2．0軟件分析。

1．2．3 透射電子顯微鏡技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1．2．2，收集不同濃度的SEA作用后的PLA801D細(xì)胞，移入錐型離心管內(nèi)，離心棄上清，應(yīng)用2．5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛－鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1．2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)結(jié)果以ˉx±s%表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS 11．0軟件分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 MTT結(jié)果 不同濃度的SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組相比差異有顯著意義。見表1。

2．2 流式細(xì)胞儀結(jié)果 不同濃度的SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖周期均有影響。G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2／M期相對(duì)增多，組間比較差異顯著。見表2。

表1 SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖抑制率

表2 SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖周期各時(shí)相影響及凋亡率

2．3 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 透射電子顯微鏡觀察不同濃度的SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變，可見線粒體腫脹、有大量空泡形成、細(xì)胞核染色質(zhì)趨邊凝集，可見凋亡小體改變。見圖1、2。

圖1 20ng／L SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞作用，可見線粒體腫脹、有空泡形成（5000×）

圖2 80ng／L SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞作用，可見染色質(zhì)趨邊凝集、可見凋亡小體（5000×）

3 討論

腫瘤生物治療是一類應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)或腫瘤生長進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制腫瘤生長［2］。因此，本研究應(yīng)用超抗原SEA觀察其對(duì)PLA801D細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，SEA是一組對(duì)熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見病因［3］。MTT結(jié)果顯示，不同濃度的SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖抑制率分別為22．8%、33．7%和42．1%，具有明顯的劑量依賴性，與對(duì)照組相比差異非常顯著，P＜0．01。因?yàn)?MTT試劑可被哺乳動(dòng)物活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成藍(lán)色的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。因此，該實(shí)驗(yàn)被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究，具有一定的客觀性和實(shí)用性。

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，不同濃度的SEA對(duì)PLA801D細(xì)胞周期進(jìn)程均有影響，SEA可抑制G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而使G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2／M期細(xì)胞相對(duì)增多，G1期細(xì)胞又稱細(xì)胞復(fù)制前期，G1期是制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA和tRNA及核蛋白體，同時(shí)G1期也是多種化學(xué)藥物作用的敏感點(diǎn)［4］。因此，抑制G1期細(xì)胞的進(jìn)程從而使細(xì)胞增殖變緩，不能進(jìn)入S期，造成S期細(xì)胞減少，達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的，而G2／M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反映［5］。G2／M期是細(xì)胞周期的兩個(gè)檢查點(diǎn)之一，是細(xì)胞增殖的重要階段，多種DNA損傷劑不僅可引起G1期阻滯，也可引起G2／M期阻滯，由于G2／M期阻滯在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，使人們聯(lián)想到它可能與細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性，腫瘤發(fā)生和治療密切相關(guān)。因此，這方面研究日益受到重視。

綜上所述，本研究應(yīng)用SEA體外觀察其對(duì)PLA801D細(xì)胞生物學(xué)行為影響，獲得了較為滿意的結(jié)果。證明SEA具有直接的細(xì)胞毒作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［6］，可以用于腫瘤局部免疫治療，具有一定的優(yōu)越性。

［1］Anglim PP，Alonzo TA，Laord－Offringa IA．DNA methylation based biomarkers for early detection of non－small cell lung cancer：an up－date［J］．Mol Cancer，2008，7：7．

［2］黃 健，李官成．抗體藥物用于腫瘤治療的研究進(jìn)展［J］．國際腫瘤學(xué)雜志，2008，35（5）：351．

［3］Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al．Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins［J］．Chem Immunol Allergy，2007，93：24．

［4］Martin LG，Demers GW，Galloway DW，Disrup－tion of the G1／S traansition in human Papiloma Viras type／6E7－expressing human cells in associated regulation of cyclin E ［J］．Virol，1998，72（2）：975．

［5］Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al．Ste20－like kinase（SLK），a regulatory kinase for polo－like（PLK）during the G2／M transition in somatic cells［J］．Genes Celss，2005（6）：491．

［6］張 云，孫嘉琳，王 雪，等．SEA體內(nèi)殺傷S180肉瘤效果及其細(xì)胞因子測(cè)定［J］．天津醫(yī)藥，2010，38（4）：313．