王朝陽，黃宗海

（1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010051；2．南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 普外科，廣東 廣州510282）

將自殺基因與化療藥物聯(lián)合是目前主要的基因治療策略，多種自殺基因已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，是非常有前景的基因治療手段［1］。但研究發(fā)現(xiàn)，單自殺基因系統(tǒng)治療效果不理想并缺乏對腫瘤細(xì)胞殺傷的靶向性。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)用2種自殺基因聯(lián)合治療以提高腫瘤的殺傷效果，利用血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，血管內(nèi)皮生長因子受體（KDR）在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的特點(diǎn)，以腫瘤血管為治療靶點(diǎn)，可以降低對正常細(xì)胞的毒性。我們前期研究已經(jīng)構(gòu)建重組腺病毒pAdEsay－KDR－CDglyTK載體［2］，本研究以KDR作為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)雙自殺基因治療，觀察其對高表達(dá)KDR的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和低表達(dá)KDR的LS174T細(xì)胞的殺傷作用，為進(jìn)一步研究此雙自殺基因治療體系的療效提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料和方法

1．1 材料

重組腺病毒pAdEsay－KDR－CDglyTK（珠江醫(yī)院普外科構(gòu)建）；HCT116、LS174（中山大學(xué)細(xì)胞庫）；293細(xì)胞（ATCC）；胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI1640（Gibco）；Trizol Reagent（invitrogen）；2×Taq PCR MasterMix（北京天根生物技術(shù)公司）；RT－PCR試劑盒（Fermentas）；5－FC、GCV、四甲唑藍(lán)（MTT）（Sigma）；CD－TK引物（上海英俊生物有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 重組腺病毒轉(zhuǎn)染HCT116、LS174T細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HCT116和LS174T細(xì)胞，以2×105個(gè)／孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%－80%，以不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的腺病毒轉(zhuǎn)染后緩慢震蕩2－3h，補(bǔ)足培養(yǎng)液在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白（GFP）陽性細(xì)胞百分比。

1．2．2 RT－PCR檢測目的基因 CDglyTK 表達(dá)收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的HCT116和LS174T細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞的總RNA，分光光度計(jì)檢測A260，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。CD－TK引 物 序 列 上 游 P1：5′－AGGCTAACAGTGTCGAATAACGCT－3′，下 游 P2：5′－GTTAGCCTCCCCCATCTC－3′。反 應(yīng) 條件：94℃ 預(yù) 變 性 5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40sec，57℃退火1min，72℃延伸1．5min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1．2．3 化療藥GCV及5－FC對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 將HCT116和LS174T細(xì)胞制成濃度為1×105／ml的單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，48h后融合度約為80%，用100MOI的重組腺病毒轉(zhuǎn)染；培養(yǎng)24h后分別加入梯度濃度的前藥，GCV為0．01mg／L，0．1mg／L，1mg／L，10mg／L，100mg／L，1 000mg／L，5－FC為20mg／L，40mg／L，80mg／L，160mg／L，320mg／L，640mg／L。培養(yǎng)72h后，加入5g／L MTT 20μl，孵育4h；吸去上清，加入200ml／孔DMSO，振搖10min，酶標(biāo)儀檢測每孔在490nm波長下的吸光度值（A），以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)3個(gè)平行孔。計(jì)算細(xì)胞相對存活率＝試驗(yàn)組OD值／對照組OD值×100%。

1．2．4 流式細(xì)胞儀（FCM）分析細(xì)胞周期及凋亡情況 將HCT116接種于6孔板中，48h后用100MOI的重組腺病毒感染，培養(yǎng)24h，加入1mg／L GCV和80mg／L 5－FC，設(shè)置陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，1 000r／min離心5min，去上清液，－20℃預(yù)冷的70%乙醇固定1h。用200μl PBS制備細(xì)胞懸液加入等體積碘化丙碇染液混合，4℃放置30min上機(jī)。ModfitLT20軟件分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化情況。

1．2．5 免疫組織化學(xué)法檢測Caspase3的表達(dá)HCT116細(xì)胞接種及轉(zhuǎn)染方法同上。將感染和未感染CD／TK基因的HCT116細(xì)胞涂片，多聚甲醛固定，3%H2O2室溫封閉5－10min，正常山羊血清封閉室溫20min，甩去多余液體。滴加兔抗人Caspase3抗體（1∶100），37℃2h，生物素抗兔IgG 37℃30min，SABC 20min，DAB顯色。各步驟之間用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3遍，梯度酒精脫水后，封片，拍照。陽性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞漿發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，每次細(xì)胞記數(shù)不少于200個(gè)，計(jì)算細(xì)胞陽性率。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果用ˉx±s表示；計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用 Mann－Whitney U秩和檢驗(yàn)分析，P＜0．05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 重組腺病毒對結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況

不同MOI的重組腺病毒轉(zhuǎn)染HCT116和LS174T細(xì)胞72h，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染率與腺病毒感染復(fù)數(shù)呈正相關(guān)，MOI＝10時(shí)，僅顯示少數(shù)微弱的熒光；MOI＝100時(shí)，90%以上的細(xì)胞表達(dá)熒光；MOI＝200時(shí)，95%以上的細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的綠色熒光，腺病毒對兩種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相似（圖1）。

2．2 Ad－KDR－CDglyTK基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

RT－PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后的HCT116內(nèi)能檢測到目的基因Ad－KDR－CDglyTK的表達(dá)，電泳圖上可見約2 400bp陽性條帶，LS174T細(xì)胞內(nèi)則未檢測到目的融和基因的表達(dá)（圖2）。

2．3 重組腺病毒AdKDR－CDglyTK轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的測定

圖1 重組腺病毒對HCT116和LS174T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況

圖2 RT－PCR鑒定CDglyTK mRNA的表達(dá)

MTT檢測結(jié)果顯示：腺病毒 AdKDR－CDglyTK轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后對前藥GCV和5－FC的敏感性較高，細(xì)胞殺傷作用呈劑量依賴性，隨前藥濃度增加，生長抑制作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）。但相同劑量的前藥對轉(zhuǎn)染腺病毒AdKDR－CDglyTK的LS174T細(xì)胞不敏感，轉(zhuǎn)染后的LS174T細(xì)胞的存活率不隨前藥濃度的改變而變化（圖3）。

圖3 AdKDR－CDglyTK對HCT116、LS174T細(xì)胞存活率的影響

2．4 以為KDR啟動(dòng)子的雙自殺基因系統(tǒng)CDglyTK促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：前藥GCV 1mg／L、5－FC 80mg／L 作用 HCT116細(xì)胞48h，HCT116細(xì)胞G0／G1升高而S期下降（P＜0．01）。治療組GO－G1期峰左側(cè)出現(xiàn)凋亡峰，凋亡率為14．83%，而陰性對照組未出現(xiàn)明顯的凋亡峰，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）（表1，圖4）。

表1 以為KDR啟動(dòng)子的雙自殺基因系統(tǒng)CDglyTK對HCT116細(xì)胞的周期分布及凋亡的影響（%）

2．5 caspase3蛋白在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)

Caspase3免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要在胞漿表達(dá)，少量胞核有微量表達(dá)。前藥GCV 1mg／L、5－FC 80mg／L作用 HCT116細(xì)胞48h，治療組caspase3蛋白表達(dá)明顯高于陰性對照組的蛋白表達(dá)，治療組陽性細(xì)胞占55．86%，陰性對照組陽性細(xì)胞占25．94%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0．01（圖5）。

3 討論

腫瘤的自殺基因治療策略是將某些細(xì)菌或病毒中對藥物敏感的基因用基因工程技術(shù)構(gòu)建到載體上導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，此基因編碼的特異性酶能將對細(xì)胞無毒或毒性低的藥物前體代謝為細(xì)胞毒性藥物，以提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性［3］。由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的復(fù)雜性，單自殺基因治療具有表達(dá)不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染效率不足、特異靶向性不強(qiáng)、對腫瘤細(xì)胞殺傷效果低等缺點(diǎn)，應(yīng)用單前藥體系很難達(dá)到根治腫瘤、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的，多個(gè)自殺基因的聯(lián)合是提高療效的主要途徑之一。

圖4 HCT116細(xì)胞的DNA含量和細(xì)胞周期

圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HCT116細(xì)胞caspase3蛋白表達(dá)（A圖為對照組，B圖為治療組）

CD／5－FC和TK／GCV是目前研究最為深入的兩種自殺基因系統(tǒng)。單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（herps simplex virus typeⅠ thymidine kinase，HSV－Ⅰ TK）催化更昔洛韋（Ganciclovir，GCV）磷酸化，經(jīng)細(xì)胞激酶轉(zhuǎn)化成三磷酸GCV，滲入到分裂細(xì)胞的DNA中，抑制DNA合成［4］。胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase，CD）將無毒的5－FC轉(zhuǎn)化為高度細(xì)胞毒性的5－FU，抑制胸苷酸合成酶活性影響DNA復(fù)制，并以偽代謝物形式滲入到RNA中，干擾RNA功能抑制蛋白質(zhì)合成［5，6］。二者作用機(jī)制相似，但作用環(huán)節(jié)不同，聯(lián)合轉(zhuǎn)染將會(huì)產(chǎn)生相加或協(xié)同效應(yīng)殺傷敏感性不同的腫瘤細(xì)胞。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)，給予前藥5－FC和GCV后轉(zhuǎn)基因HCT116細(xì)胞被阻滯于G0－G1期，S期下降，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，提示結(jié)腸癌細(xì)胞的DNA合成被抑制，雙自殺基因系統(tǒng)能特異性抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖。

基因治療的關(guān)鍵是將目的基因片段高效地導(dǎo)入靶細(xì)胞并獲得有效穩(wěn)定的表達(dá)。治療的靶向性是優(yōu)化基因治療策略的重要環(huán)節(jié)，利用腫瘤組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)自殺基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)是實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的靶向性、提高轉(zhuǎn)染效率的有效手段。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）能增強(qiáng)小血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的代謝、引起血管外基質(zhì)成分改變刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，在血管新生中起重要作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF的表達(dá)水平能反映腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管構(gòu)建水平，直接反映腫瘤生長速度和轉(zhuǎn)移傾向［7］。在實(shí)體腫瘤原發(fā)灶及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中可檢測到的VEGF及其受體（KDR）表達(dá)水平明顯升高，而在正常血管表達(dá)弱或不表達(dá)［8］。因此。本研究構(gòu)建以KDR為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)雙自殺基因系統(tǒng)，將有高度腫瘤特異性KDR與雙自殺基因系統(tǒng)結(jié)合起來，提高自殺基因系統(tǒng)對腫瘤組織及腫瘤血管的靶向性而對正常組織影響較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Ad－KDR－CDglyTK后，表 達(dá) KDR 的 結(jié) 腸 癌 細(xì) 胞HCT116的生存率隨前藥5－FC和GCV濃度的增加而遞減，而不表達(dá)KDR的LS174T細(xì)胞生存率則幾乎不受影響。證實(shí)以KDR為啟動(dòng)子調(diào)控雙自殺基因系統(tǒng)能增強(qiáng)腫瘤組織的靶向特異性、提高轉(zhuǎn)染效率。

Caspase家族被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，Caspase－3廣泛存在于正常人體組織及多種腫瘤組織中，正常情況下，胞質(zhì)內(nèi)的caspase－3以無活性的酶原形式存在，只有當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)才被激活為有活性的caspase－3，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，caspase－3水解底物蛋白，引起細(xì)胞凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)的方法檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白含量，結(jié)果顯示治療組的caspase－3蛋白表達(dá)明顯高于對照組，說明前藥作用于轉(zhuǎn)基因HCT116細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)caspase－3活性升高，增強(qiáng)caspase－3促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，以KDR基因?yàn)閱?dòng)子可以提高對腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管組織的靶向性，雙自殺基因系統(tǒng)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率、提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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