魏麗萍 陳鐵龍 赫小龍 祝光禮

（浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

隨著社會發(fā)展及生活方式的轉變，心血管疾病日益增多，尤其急性心肌梗死，其發(fā)病急，致死率高，已成為嚴重影響我國人民健康的疾病。黃芪失笑散臨床應用可以有效緩解冠心病心絞痛癥狀，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗動脈粥樣硬化、保護血管內皮功能及促血管新生的作用［1-3］。本研究通過觀察該方對急性心肌梗死大鼠心功能及細胞凋亡相關蛋白的影響，進一步探討其對缺血心肌保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠120只，浙江省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2008-0033，體質量180～220 g。

1.2 藥物與試劑 黃芪失笑散（組成：黃芪30 g，蒲黃20 g，五靈脂20 g，濃縮成2 g/mL的生藥煎劑，本院制劑室提供）；Caspase-8兔多克隆抗體、一抗稀釋液、HRP標記二抗（杭州達文生物有限公司）；蛋白質定量試劑盒（BCA法，北京普利萊基因技術有限公司）。

1.3 大鼠急性心梗模型的建立 將120只SD大鼠隨機分為5組，每組24只。模型組（灌胃滅菌蒸餾水2 mL/d），黃芪失笑散大、中、小劑量組（每日灌胃黃芪失笑散 28、14、7g/kg）、對照組（灌胃滅菌蒸餾水 2mL/d），連續(xù)灌胃7 d后進行造模。大鼠麻醉后，予氣管插管及呼吸機輔助呼吸。于心尖搏動處暴露心臟并打開心包，結扎左冠狀動脈前降支，心電圖出現(xiàn)ST段明顯弓背抬高提示急性心梗造模成功。后關閉胸腔，待動物恢復自主呼吸后，拔除插管，停呼吸機。對照組除不結扎冠狀動脈外，其余手術過程一致。

表1 兩組大鼠血流動力學指標比較（±s）

表1 兩組大鼠血流動力學指標比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃芪失笑湯小劑量組比較，#P＜0.01，##P＜0.05。下同。

組 別 n對照組 8模型組 8黃芪失笑湯小劑量組 8 LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）-dp/dtmax（mmHg/s）146.6±5.5** 6.0±1.9** 5894.1±672.2** 4839.6±239.8**76.3±24.3△△ 17.9±2.7△△ 3699.8±390.0△△ 2695.0±182.3△△100.7±5.8△△ 12.1±2.1**△△ 4003.3±515.7△△ 3122.9±164.6**△△黃芪失笑湯中劑量組 8 111.2±20.3*△ 8.4±1.3** 5052.3±536.5**△△ 4214.7±378.7**△△黃芪失笑湯大劑量組 8 123.5±23.1** 6.5±1.9** 5444.1±583.9**△△# 4498.7±499.5**△#

1.4 血流動力學檢測 術后4.5 h行血流動力學檢測。大鼠麻醉后，分離右側頸總動脈，三通管連接20 G靜脈鞘管和壓力換能器，在頸總動脈插入鞘管，通過Medlab-U/4 CS生物信號采集處理系統(tǒng)觀察壓力曲線，測量并記錄每只大鼠的左室內壓峰值（LVSP）、左室等容收縮末期壓力上升最大速度（+dp/dtmax），左室舒張末壓力（LVEDP）、左室壓力下降最大速度（-dp/dtmax）等參數(shù)。

1.5 Western Blot法測定心肌Caspase-8蛋白的表達取各組大鼠左室梗死邊緣區(qū)心肌組織，蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取各組樣品50 μg，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，用5％脫脂奶粉室溫搖床封閉1.5 h后，加入一抗4℃孵育過夜，后脫洗3次，然后加入二抗室溫下?lián)u床孵育1.5 h，后脫洗3次。ECL發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Image J軟件進行圖像分析，以β-actin（1∶1000稀釋）作為內參照對比，比值結果表示其蛋白的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪失笑散對血流動力學影響 見表1。與模型組相比，黃芪失笑散大、中劑量組可明顯改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax（P＜0.05 或 0.01）。與對照組比較，黃芪失笑散大劑量組在LVSP變化上無明顯差異（P＞0.05）；黃芪失笑散大劑量組在改善+dp/dtmax和-dp/dtmax方面與小劑量組有明顯差異 （P＜0.05），且存在 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax隨黃芪失笑湯劑量的提高而升高的趨勢，LVEDP隨黃芪失笑湯劑量的提高而降低的趨勢，說明黃芪失笑散對心梗后大鼠血流動力學改善呈劑量依賴性，其中黃芪失笑散大劑量對血流動力學各指標改善程度最高。

2.2 黃芪失笑散對Caspase－8蛋白表達的影響 見表2。與對照組比，模型組Caspase-8蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。黃芪失笑散大、中劑量組與模型組相比，Caspase-8蛋白表達明顯降低（P＜0.05或0.01）。黃芪失笑湯各劑量組間兩兩比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但是存在Caspase-8蛋白的表達水平隨黃芪失笑湯劑量的提高而降低的趨勢，說明黃芪失笑散對Caspase-8蛋白表達的調節(jié)作用呈劑量依賴性，其中大劑量組的抑制作用較強（圖1）。

3 討論

急性心肌梗死是臨床常見急危重癥，心肌壞死的范圍與預后密切相關。目前研究表明細胞死亡有壞死和凋亡兩種機制，而凋亡先于壞死發(fā)生，是梗死灶擴大的主要因子，并且存在于心肌梗死病理改變全過程［4］。因其具有可調控性，所以AMI的細胞凋亡領域成為了現(xiàn)代研究的熱點。Caspase家族 （Caspase-1～Caspase-14）參與細胞凋亡的全過程，是細胞凋亡的核心成分，其中Caspase-8是家族中細胞凋亡的啟動者之一，可以在外界促細胞凋亡因子的刺激下發(fā)生酶切而變?yōu)橛谢钚缘腸leaved Caspase-8（相對分子量18 kDa），從而啟動Caspase級聯(lián)反應，最終活化執(zhí)行者Caspase-3引起細胞凋亡。

中醫(yī)學并無急性心肌梗死的病名，多歸于 “真心痛”或“胸痹心痛”范疇，病機多與氣虛血瘀有關，故治療以益氣活血為主。黃芪失笑散以 《太平惠民和劑局方》中之失笑散為基礎，加用大劑量黃芪，全方共奏益氣活血、散結止痛之效。而現(xiàn)代研究表明黃芪及失笑散均有抑制細胞凋亡的作用［5-8］。本研究顯示黃芪失笑散可改善心肌梗死大鼠的心功能，下調活化的Caspase-8蛋白表達量，并呈劑量相關性，其中以大劑量組效果最好，從而進一步證實了該方抗心肌缺血的確切作用，并揭示其機制與抑制Caspase-8的活化從而減少細胞凋亡有關，為臨床進一步推廣應用提供了較好的理論依據(jù)。

組 別 n對照組 6模型組 6黃芪失笑湯小劑量組 6 Caspase-8 0.26±0.07**0.54±0.13△△0.41±0.10黃芪失笑湯中劑量組 6 0.33±0.09*黃芪失笑湯大劑量組 6 0.28±0.02**

圖1 各組大鼠心肌組織Caspase-8蛋白的表達結果

［1］祝光禮，魏麗萍，方偉，等.黃芪失笑散對大鼠動脈粥樣硬化的保護作用［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2008，26（8）：1614-1616.

［2］祝光禮，魏麗萍，方偉，等.黃芪失笑散對血管內皮功能的影響［J］.浙江臨床醫(yī)學，2008，10（8）：1016-1018.

［3］祝光禮，范翠娟，陳鐵龍，等.黃芪失笑散對雞胚絨毛尿囊膜促血管生成實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（12）：2462-2464.

［4］謝志泉，劉伊麗.細胞凋亡與缺血性心臟病［J］.臨床心血管病雜志，1999，15（10）：474.

［5］馬蘭，關振中.黃芪注射液對大鼠左室重構及凋亡基因Caspase-3 的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2005，25（7）：646-649.

［6］趙淑敏，孔祥玉，周健，等.黃芪預處理對缺血再灌注大鼠心肌超微結構的保護作用［J］.中國臨床康復，2005，9（27）：80-81.

［7］馮津萍，盧奕，趙炳讓，等.黃芪抑制家兔心肌缺血再灌注時細胞凋亡的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結合急救雜志，2001，8（1）：13-15.

［8］周小青，王大安，羅堯岳，等.活血化瘀類方干預急性心肌缺血犬心肌組織病理改變及心肌細胞凋亡的實驗研究［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2003，1（12）：707-708.