蔡本強 賀勁松 邢宇鋒 馬曉軍

1.廣州中醫(yī)藥大學深圳附屬醫(yī)院肝病科 (廣東深圳，518033) 2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學科學院感染科

慢性HBV感染時，樹突狀細胞、T細胞免疫功能低下，誘導產(chǎn)生強烈的HBV特異性CTL免疫應答，是乙肝疫苗研制的關(guān)鍵內(nèi)容。在前期對補腎解毒方能調(diào)節(jié)T細胞的免疫功能及具有抑制HBV DNA作用研究基礎(chǔ)上，本研究使用PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1通路，并以補腎解毒方輔助免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察其對小鼠CTL細胞免疫應答的影響，為尋找能有效抗HBV免疫方法提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，SPF級，雌雄不限，8～10周齡，20～30g，購自廣州空軍醫(yī)院實驗動物中心。HepG 2.2.15細胞為本室自行傳代培養(yǎng)。

1.2 實驗藥物與試劑 補腎解毒方:由仙靈脾30g，菟絲子10g，杜仲、懷牛膝、枸杞子、枳殼、郁金、印度葉下珠各15g組成;文火煎煮，制成中藥湯劑，使用時用藥濃度為生藥含量2.51g/ml。PD-L1單克隆抗體、對照抗體IgG2a購自美國eBioscience公司。PBS本室自行配制。HBsAg蛋白由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，重組小鼠IL-2為Peprotech公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的抗小鼠CD8單克隆抗體、別藻藍蛋白 (APC)標記抗PD-1流式抗體購自美國ebioscience公司。流式洗滌液為含5g/L BSA，1g/L NaN3的PBS。IFN-γ ELISA試劑盒購自晶美公司。非放射性乳酸脫氫酶 (LDH)釋放法檢測試劑盒Cyto Tox 96購自美國promega公司。

1.3 主要實驗儀器 FACSCalibur流式細胞儀為美國BECTON DICKINSON產(chǎn)品。瑞士Tecan SUNRISE酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，每組10只。給予相應處理方法，共分4組，即聯(lián)合組:給予補腎健脾解毒方聯(lián)合PD-L1抗體;對照組設(shè)補腎解毒方組、PDL-1抗體組和PBS組，分別給予補腎解毒方+對照抗體IgG2a、PDL-1抗體+PBS、對照抗體IgG2a+PBS。

1.4.2 給藥方式 補腎解毒方:使用時用藥濃度為生藥含量2.51g/ml，每次灌胃2ml/只，2次/d。PBS:每次灌胃2ml/只，2次/d。PD-L1抗體或?qū)φ湛贵w IgG2a:腹腔注射，200μg/只，每3日1次，共4次。

1.4.3 實驗方案 各組小鼠給予相應藥物治療兩周。在治療結(jié)束后脫臼處死小鼠，取脾臟，按常規(guī)方法制備濃度為5×106/ml的細胞懸液分別進行以下相應實驗檢測。

1.4.4 脾臟細胞上清液細胞因子檢測 將各組小鼠脾臟細胞分別加入24孔培養(yǎng)板 (1ml/孔)，加 HBsAg(10μg/ml)刺激，37℃、5%CO2培養(yǎng)48小時后，收集培養(yǎng)上清液置于－20℃待檢。嚴格按ELISA試劑盒說明進行操作，酶標儀檢測IFN-γ分泌水平。

1.4.5 T細胞表面PD-1分子表達檢測 上述脾臟細胞，在24孔培養(yǎng)板中用含rhIL-2(100U/ml)的RMPI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第4天時，收集細胞，PBS重懸，調(diào)整濃度為5×106/ml。取1×106個細胞，分別加入APC標記的抗小鼠PD-1抗體、FITC標記的抗小鼠CD8抗體各20μl，室溫避光孵育20分鐘;PBS液洗滌1次，加入PBS 200μl重懸，上流式細胞儀檢測。每份標本設(shè)空白對照。

1.4.6 LDH釋放法檢測HBsAg特異性CTL活性 ①小鼠脾臟淋巴細胞，用含2mg/L的 ConA、100U/ml rhIL-2、HBsAg蛋白的RMPI-1460完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3天，并調(diào)整細胞密度為1×109/L，此即特異性實驗中的效應細胞 (HBsAg特異性CTL)。②HepG 2.2.15細胞傳代培養(yǎng)，收集后，PBS重懸，調(diào)整濃度為1×107/ml。以HepG 2.2.15細胞作為靶細胞，效靶比分別為25∶1，50∶1，100∶1，共培養(yǎng)4小時后，按Cyto Tox 96試劑盒說明書進行殺傷活性檢測。CTL殺傷活性=(效靶混合細胞釋放OD值－靶細胞自然釋放OD值)/(靶細胞最大釋放OD值－靶細胞自然釋放OD值)×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5軟件進行相關(guān)統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，以方差分析，t檢驗分析數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 脾細胞上清液分泌IFN-γ水平及CD8+T細胞表面PD-1分子表達水平 見表1。脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清液IFN-γ分泌水平，聯(lián)合組明顯高于PD-L1抗體組、補腎解毒方組、PBS組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性意義 (P＜0.01或0.05);補腎解毒方組、PDL1抗體組分別與PBS組比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01或0.05);補腎解毒方組與PD-L1抗體組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CD8+淋巴細胞表面PD-1分子表達水平，聯(lián)合組明顯低于PD-L1抗體組、補腎解毒方組、PBS組，差異有顯著性意義 (P＜0.01);補腎解毒方組、PD-L1抗體組分別與PBS比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01);補腎解毒方組與PD-L1抗體組比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01)。

表1 小鼠脾臟淋巴細胞IFN-γ分泌水平及CD8+T細胞表面PD-1分子表達水平(±s)

表1 小鼠脾臟淋巴細胞IFN-γ分泌水平及CD8+T細胞表面PD-1分子表達水平(±s)

與PBS組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與聯(lián)合組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與PDL-1組比較，##P＜0.01

組別 n IFN-γ(ng/ml) CD8+PD-1+細胞 (%)PBS組 10 121.22±21.33＊＊ 22.5±4.76＊＊補腎解毒方組 10 148.53±22.65△＊＊ 19.3±3.24△△＊＊##PDL-1組 10 159.32±27.35△△＊ 12.2±3.67△△＊＊聯(lián)合組 10 187.72±29.67△△ 6.7±2.06△△

2.2 小鼠脾臟HBsAg特異性T淋巴細胞殺傷活性 見表2。如表2所示，各組小鼠脾臟HBsAg特異性T淋巴細胞殺傷活性比較:效靶細胞比例為100∶1或50∶1時，聯(lián)合組明顯高于PDL-1抗體組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性意義 (P＜0.05);聯(lián)合組、PDL-1抗體組高于補腎解毒方組及PBS，統(tǒng)計學分析差異有顯著性意義 (P＜0.01或0.05);補腎解毒方組與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。

效靶細胞比例為25∶1時，脾臟HBsAg特異性T淋巴細胞殺傷活性，聯(lián)合組高于PBS組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性意義，(P＜0.05);補腎解毒方組、PDL-1抗體組分別與PBS組、聯(lián)合組比較，均無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。

表2 各組小鼠脾臟HBsAg特異性T淋巴細胞殺傷活性

3 討論

宿主對HBV抗原產(chǎn)生不同程度的特異性免疫無應答即免疫耐受，T細胞處于無能或耗竭狀態(tài)，被認為是HBV感染慢性化的主要機制［1］。而HBV特異性T細胞免疫應答，尤其是CTL是清除HBV感染的重要方式。因此，有效地清除HBV離不開機體T細胞免疫的重建。

在急性和慢性HBV感染的研究中發(fā)現(xiàn)，耗竭或免疫無能的T細胞表面高表達PD-1，導致機體對HBV的免疫耐受［2］。阻斷PD-1/PD-L1信號通路，被證實可以恢復病毒感染時無能T細胞的功能，增強疫苗的特異免疫水平［3，4］。封閉PD-l/PDL1通路，如使用PD-L1抗體方法，有可能逆轉(zhuǎn)病毒持續(xù)感染和慢性感染。目前該方法應用在抗HBV感染方面較少，有待在HBV轉(zhuǎn)基因動物及臨床中進一步研究。

近年來我們依據(jù)乙型肝炎“正虛濕熱毒邪入侵”的發(fā)病機理，采用補腎清透法和補腎健脾法治療慢性乙型肝炎及攜帶者，在抑制HBV DNA復制及e抗原的陰轉(zhuǎn)皆有較好的療效，且對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠MHC(主要組織相容性復合體)Ⅰ和MHCⅡ分子表達及T細胞的免疫功能方面有一定的調(diào)節(jié)作用［5～7］。本研究補腎解毒方中菟絲子、仙靈脾、杜仲、懷牛膝為補腎方陣，共為君藥，針對乙型肝炎的正虛本質(zhì)，固補腎精，可鼓邪外出;葉下珠性苦寒，具清熱解毒利濕之效，為臣藥;枳殼、郁金行氣活血，共為佐藥;枸杞子為使藥，引諸藥入肝血。全方組成針對慢性乙型肝炎的核心病機，君臣佐使配伍合理，先后天并補，虛實兼治，清、補、活一體，共奏補腎解毒、活血利濕之功。為進一步明確HBV慢性感染時補腎解毒方對T細胞免疫的調(diào)理作用，我們使用該制劑聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1信號通路的方法，觀察其對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠特異性T細胞應答水平、T細胞表面PD-1水平的影響，同時探討促進T細胞功能恢復的有效方法。

本研究結(jié)果表明，PD-L1抗體可以阻斷PD-1/PD-L1信號通路，降低T細胞表面PD-1分子的表達;提高小鼠脾臟淋巴細胞IFN-γ分泌水平;并且能夠顯著提高HBsAg特異性CTL殺傷活性。使用補腎解毒方后，PD-L1抗體引起的上述免疫變化進一步增強。提示，補腎解毒方增強應用PD-L1抗體對T細胞功能的恢復作用，能增強特異性T細胞免疫應答水平。

Boni等利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，證實病毒特異性T細胞分泌IFN-γ水平與表面PD-1表達呈負相關(guān)［8］。而本研究結(jié)果提示，補腎解毒方能顯著促進HBV轉(zhuǎn)基因小鼠脾細胞分泌IFN-γ水平。因此，補腎解毒方能調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子的分泌，誘導產(chǎn)生大量IFN-γ，可能為其能減少PD-1表達，提高T細胞免疫功能的原因之一。

總之，本研究表明，阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以恢復慢性HBV感染時特異性T細胞功能，聯(lián)合補腎解毒方則具有顯著的協(xié)同作用。使用合適的中藥方劑證實能有效調(diào)整慢性HBV感染時T細胞的免疫功能，這無疑為進一步研究重建機體HBV特異性免疫和研制有效的抗HBV的免疫治療方法提供良好的科學證據(jù)和新的思路。

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