王禮鳳，李長(zhǎng)秦，馮海杲，鄭旭銳，曹寧

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046;2.汾陽(yáng)市中醫(yī)學(xué)會(huì)，山西 汾陽(yáng) 032200)

乙型肝炎是由HBV引起的，以肝臟炎性病變?yōu)橹鞯囊环N傳染性疾病。目前公認(rèn)的抗病毒治療藥物主要是干擾素及核苷類(lèi)等，但其療效均不理想。新加達(dá)原飲(Influence of XinjiaDaYuanYin，IXJDY)是在我國(guó)明代著名醫(yī)家吳又可創(chuàng)立的達(dá)原飲的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐加減變化組成的、對(duì)慢性乙型肝炎具有較好治療效果的經(jīng)驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)染HBV DNA全基因HepG2.2.15細(xì)胞株為對(duì)象，研究新加達(dá)原飲體外抗HBV的效果。

1 材料

HepG 2.2.15細(xì)胞株購(gòu)自上海佛雷堡生物發(fā)展公司;新加達(dá)原飲藥液由陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制取。

HBsAg和HBeAg酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(西安永屹生物發(fā)展有限公司，批號(hào)CK－E10545H);1640培養(yǎng)基(Gibico公司，批號(hào)3856);胎牛血清(Hyclone公司，批號(hào)20060404);G418(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)108321－42);0.25%胰酶(Trypsin，Gibco公司，批號(hào) 0527);拉米夫定(lamivudine，3TC，葛蘭素史克制藥有限公司，批號(hào)09030037);四甲基偶氮唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)，二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)。

2 方法

2.1 IXJDY含藥培養(yǎng)液的配制 將新加達(dá)原飲藥物加入1 000ml水煎煮40min，第2次加入500ml水煎煮0.5h，合并煎液，濾過(guò)后得水煎液500ml;將煎好的藥液冷卻濃縮至每毫升含生藥1g，然后醇沉使其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，即用900ml乙醇靜置24h后取上混懸液離心，然后將乙醇回收并定容至350ml備用，然后在超凈工作臺(tái)先用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，再用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝于無(wú)菌的玻璃瓶中保存于4℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)液將IXJDY稀釋成所需終濃度的應(yīng)用液。

2.2 IXJDY的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Mosmann建立的四甲基噻唑藍(lán)(MTT法)比色法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。將2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，置CO2孵箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸除全部培養(yǎng)液，加入用完全培養(yǎng)液將IXJDY系列5 倍稀釋成200，40，8，1.6，0.32mg/mL 的應(yīng)用液100μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTT 10μL，于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后小心吸棄上清液后，每孔加DMSO 100μL，微量振蕩器振蕩5min，使結(jié)晶紫完全溶解。自動(dòng)酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm)讀取各孔OD值，記錄結(jié)果。按Reed－Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒濃度(TC50)和最大無(wú)毒濃度(TC0)。TC50=Antilog［B+(50－B)/(A －B)×C］，A=log＞50%藥物濃度，B=log＜50%藥物濃度，C=log釋稀倍數(shù)。

2.3 IXJDY 對(duì) HepG2.2.15 細(xì)胞分泌 HBV DNA 的影響

將2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1mL，置 CO2孵箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸除全部培養(yǎng)液，根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果，分別加入最大無(wú)毒濃度以下系列2倍稀釋成5個(gè)終質(zhì)量濃度的應(yīng)用液:8(A組)、4(B組)、2(C 組)、1(D 組)、0.5(E 組)mg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以等量的完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照，以證實(shí)有效的拉米夫定(3TC，0.1mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照藥。連續(xù)培養(yǎng)72h后，分別吸出上清液于1.5mL滅菌Eppendorf管中，－20℃保存，統(tǒng)一待檢。再次加入上述含不同濃度藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h后，分別吸出上清液于1.5mL滅菌Eppendorf管中，－20℃保存，統(tǒng)一待檢。

將裝有上清液的冷藏管進(jìn)行逐一排序標(biāo)號(hào)，用離心機(jī)分離，然后移入生物安全柜，從每個(gè)離心好的冷藏管中取40ul上清液加入離心管中，然后在每個(gè)離心管中加入40μl的DNA提取液，置于漩渦混合器振蕩混勻5s，取出樣品放置于100℃恒溫加熱金屬儀，煮10min，冷確后移入離心機(jī)12 000r/min離心5min后將離心管取出，送到生物安全柜，從每個(gè)管中吸取上清液2μl加入DNA反應(yīng)管，將反應(yīng)管蓋好置于離心機(jī)離心20s，使上清液在 PCR管中穿過(guò)蠟層與反應(yīng)管中的HBV－PCR反應(yīng)液Taq酶系充分結(jié)合，上機(jī)檢測(cè)結(jié)果并記錄數(shù)據(jù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以(±s)表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 IXJDY 對(duì) HepG2.2.15 細(xì)胞毒性

按照Reed－Muench法計(jì)算得出:TC0=8.13mg/mL，TC50=14.22mg/mL，即當(dāng)藥物濃度≤TC0時(shí)，HepG2.2.15細(xì)胞無(wú)論在形態(tài)上還是數(shù)量上與空白對(duì)照組比較沒(méi)有發(fā)生明顯變化。結(jié)果提示，IXJDY對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞毒性較低，見(jiàn)表 1。

表1 新加達(dá)原飲對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞毒性的毒性作用(±s，n=6)

表1 新加達(dá)原飲對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞毒性的毒性作用(±s，n=6)

組別 終濃度(mg/mL) OD值 細(xì)胞存活率(%)空白對(duì)照組 —0.683 ±0.085新加達(dá)原飲1 組 200 0.154 ±0.045 22.5新加達(dá)原飲2 組 40 0.32 ±0.036 46.9新加達(dá)原飲3 組 8 0.649 ±0.083 95.3新加達(dá)原飲4 組 1.6 0.665 ±0.078 97.4新加達(dá)原飲5組0.32 0.677 ±0.143 99.1

表2 新加達(dá)原飲對(duì)HepG2.2.15分泌 HBV DNA的抑制作用(±s，n=3)

表2 新加達(dá)原飲對(duì)HepG2.2.15分泌 HBV DNA的抑制作用(±s，n=3)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

72h 144h(%) 拷貝數(shù) 抑制率(%)空白組組別 藥物濃度(mg/mL)拷貝數(shù) 抑制率7.560 ±0.578 7.226 ±0.576 3TC 0.1 4.677 ±0.319* 38.1 3.405 ±0.535＊＊ 52.9 A 組 8 3.924 ±0.192＊＊48.1 2.168 ±0.619＊＊ 70.1 B 組 4 4.138 ±0.481＊＊45.3 2.416 ±0.142＊＊ 66.6 C 組 2 4.251 ±0.593＊＊44.1 2.903 ±0.196＊＊ 59.8 D 組 1 4.652 ±1.115* 38.5 3.384 ±0.965＊＊ 53.2 E 組 0.5 5.213 ±0.851* 31.1 4.103 ±1.164＊＊43.2

3.2 IXJDY 對(duì) HepG2.2.15 細(xì)胞上清液中 HBV DNA的抑制作用

陽(yáng)性對(duì)照藥物3TC和IXJDY在最大無(wú)毒濃度下作用 72h，144h后，對(duì) HepG 2.2.15 細(xì)胞分泌 HBV DNA均有一定抑制作用，與空白組比較，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)較明顯的量效和時(shí)效反應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表2。

4 討論

乙型肝炎是由HBV感染所引起的慢性肝臟炎癥性病變，發(fā)病率高，目前抗病毒藥物很難徹底清除病毒，長(zhǎng)期遷延不愈，部分患者將轉(zhuǎn)化為肝硬化、肝癌，或者病情惡化發(fā)生肝衰竭，最終引起死亡，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乙肝病毒屬外感邪氣，從其致病特征分析將其歸納為濕熱疫毒之邪，本病的產(chǎn)生與肝膽脾胃臟腑關(guān)系密切，因脾為濕土之臟，易受濕熱所犯，濕熱困脾，不能運(yùn)化水谷，日久濕邪停滯、精微不化，氣虛濕盛;濕熱中阻，熏蒸肝膽，肝失疏泄，橫逆犯脾，脾氣益?zhèn)?濕熱疫毒膠著難解，以致肝膽脾胃互相影響，是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化，臨床治療難以速效的根本原因。本實(shí)驗(yàn)所用新加達(dá)原飲，是以《溫疫論》中達(dá)原飲為基本方，在多年臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上不斷篩選優(yōu)化而成，也曾以消毒丹、消毒飲為名進(jìn)行過(guò)臨床觀察?！稖匾哒摗愤_(dá)原飲由草果、蒼術(shù)、檳榔、黃芩、白芍組成，具有開(kāi)達(dá)膜原，辟穢化濁之功效，是治療濕熱疫毒之邪留滯膜原的證候。新加達(dá)原飲在達(dá)原飲中加入葉下珠、厚樸、柴胡、丹參、姜黃、僵蠶、靈芝、甘草、蟬蛻，全方重用葉下珠、蒼術(shù)為君，其中葉下珠清熱解毒，蒼術(shù)燥濕健脾，兩藥相伍清熱祛濕各擅其長(zhǎng)。以黃芩、厚樸、檳榔為臣，黃芩清熱燥濕瀉火解毒，厚樸行氣燥濕，檳榔行氣利水，三味藥相互協(xié)同加強(qiáng)祛濕清熱之功。柴胡與白芍配伍柴胡疏肝理氣，白芍柔肝斂陰，既能養(yǎng)肝體，又能助肝用，姜黃、僵蠶、蟬蛻活血化瘀，理氣通絡(luò)，靈芝既可扶正祛邪，又可防止邪氣內(nèi)傳。方中僵蠶能升陽(yáng)中之陽(yáng)氣，姜黃、檳榔降陰中之濁陰，一升一降，內(nèi)通外和，而雜氣之流毒頓消;用柴胡配伍姜黃，一升一降加強(qiáng)氣機(jī)舒暢的功能;諸藥配合可使氣機(jī)通暢，濕熱清除，氣血調(diào)和。故本方意在清熱利濕解毒，疏肝理氣活血。圓機(jī)活法，方證對(duì)應(yīng)，臨床用于治療慢性乙型肝炎取得較好療效［1－2］。

實(shí)驗(yàn)所用 HepG2.2.15 細(xì)胞模型是 Sells等人［3］在1987年將克隆的個(gè)頭尾相連的HBV DNA全基因及抗G418質(zhì)粒直接導(dǎo)入受體細(xì)胞—人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞構(gòu)建而成。該細(xì)胞不僅支持HBV DNA的復(fù)制，且支持Dane樣顆粒的包裝與分泌［4］，是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)且廣泛用于抗HBV藥物篩選和評(píng)價(jià)等研究的模型。應(yīng)用HepG2.2.15細(xì)胞證實(shí)中藥在體外的抗乙肝病毒作用的研究屢見(jiàn)不鮮，從1982年Thyagarajan 等［5］首次利用 HepG2.2.15 模型證實(shí)了苦味葉下珠的體外抗病毒作用，單味中藥、中藥單體化合物及有效成分抗HBV活性的研究越來(lái)越受到重視。中藥復(fù)方制劑雖然臨床療效顯著，但因其成分復(fù)雜，普通的制取工藝難以清除雜質(zhì)等，通過(guò)細(xì)胞學(xué)研究其抗HBV還比較少。本實(shí)驗(yàn)觀察到，新加達(dá)原飲具有較好地體外抗HBV的效果，為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，同時(shí)也證實(shí)本方組方的思路符合慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制。

為了排除藥物非特異性細(xì)胞毒性作用造成細(xì)胞死亡而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醇水雙提工藝制取藥液，盡量減少中藥復(fù)方雜質(zhì)對(duì)細(xì)胞活性的影響，并采用MTT法觀察了IXJDY對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，TC50=14.22mg/mL，TC0=8.1mg/mL，提示IXJDY在8.0mg/mL以下濃度對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞是無(wú)毒的，可以以此濃度作為實(shí)驗(yàn)的起始藥物濃度。實(shí)驗(yàn)表明，新加達(dá)原飲在體外具有較好的抗HBV作用，與臨床應(yīng)用所反映出的療效一致，但其確切的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］李長(zhǎng)秦，劉國(guó)強(qiáng)，杜衛(wèi)星，等.柴胡甘露飲治療慢性乙型肝炎193例［J］.吉林中醫(yī)藥，2003，23(8):12 －13.

［2］李長(zhǎng)秦，郝明霞，劉國(guó)強(qiáng)，等.加味消毒丹治療慢性肝炎停藥后遠(yuǎn)期臨床療效隨防［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30(1):17 －18.

［3］Sells MA，Chen ML，Acs G.Production ofhepatitisB virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitisB virusDNA［J］.Proc-NatlAcad SciUSA，1987，84(4):1005 －1009.

［4］Sells MA，Zelent AZ，Shvartsman M，et al.Replicative intermediates of hepatitisB virus inHepG2 cells thatproduce infectiousvirions［J］.JVirol，1988，62(8):2836 －2844.

［5］Thyagarajan SP，Thiruneelakantan K，Subramanian S，et al.Invitroinactivation of HbsAg by Ecliptaalba Hasskand Phyllan－thusniruri Linn［J］.Indian J Med Res，1982，76(Suppl):124－130.