敖鵬，周忠光，韓玉生，尹麗穎，邊曉燕

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)和臨床研究，滑膜病變與細(xì)胞免疫、體液免疫的關(guān)系得到了進(jìn)一步的明確［1－2］。絕大多數(shù)患者不僅血清類風(fēng)濕因子(RF)含量升高，且TNF－α、IL－1β、IL－6等細(xì)胞因子含量亦升高，這些細(xì)胞因子則是 RA發(fā)病的重要因素［3－4］。本項目在研究了伸筋草乙醇和正丁醇提取物對AA大鼠血清RF、TNF－α、IL－1β、IL－6含量影響的基礎(chǔ)上［5－7］，研究氯仿提取物對上述各因子的影響，進(jìn)一步探討伸筋草不同有效部位治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用及免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

伸筋草氯仿提取物(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心制備);甲氨喋呤(廣州石歧制藥廠);弗式完全佐劑(美國sigma公司);RF ELISA試劑盒(上海華壹生物科技有限公司);TNF－α、IL－1β、IL－6放射免疫試劑盒(北京福瑞生物工程公司)。

1.2 主要儀器

Stat Fax2100型酶標(biāo)儀(美國TEC HONLOGYIN公司);γ放免計數(shù)器(GC－2016型，科大創(chuàng)新股份中佳公司)。

1.3 動物與分組

Wistar大鼠50只，清潔級，2～3月齡，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組，即正常對照組、模型組、西藥對照組(甲氨喋呤MTX組)、伸筋草氯仿提取物高劑量治療組(伸氯高組)、伸筋草氯仿提取物低劑量治療組(伸氯低組)。

1.4 造模與給藥

除正常對照組外，各實驗組采用CFA制造佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。參照文獻(xiàn)方法［5－9］:實驗第1天，各實驗組大鼠于右后足跖部位皮下注射弗式完全佐劑0.1mL/只，然后在尾巴1/3交界處皮下再注射弗式完全佐劑0.05mL/只;正常對照組注射等量的生理鹽水。

實驗第8天開始灌胃給藥。伸氯高組和伸氯低組分別灌服伸筋草氯仿提取物混懸液，每日1次，每次1mL，連續(xù)服藥 21天，其中伸氯高組含生藥量1 600 mg/mL(8.89g/kg/d);伸氯低組含生藥量800mg/mL(4.44g/kg/d);MTX組，每周灌服MTX混懸液1次，每次1mL，濃度為1.5mg/kg/w;正常對照組和模型組灌服等量蒸餾水。

1.5 取材與檢測

于藥物治療21天后，每只大鼠分別采血3mL，3 000r/min離心10min，分離血清，置－20℃冰箱保存。采用ELISA法檢測RF，放射性免疫法檢測TNF－α、IL－1β和IL－6。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

經(jīng)上述方法檢測的各組數(shù)據(jù)，應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 伸筋草氯仿提取物對AA大鼠血清RF含量的影響

應(yīng)用ELISA法檢測各組大鼠血清RF含量，檢測結(jié)果見表1。

表1 各實驗組大鼠血清RF檢測結(jié)果(±s)

表1 各實驗組大鼠血清RF檢測結(jié)果(±s)

注:與正常組相比，△△P＜0.01;與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

分組 n RF(pg/mL)10 33.67 ±3.51模型組 10 81.92 ±3.86△△MTX 組 10 75.34 ±6.55*伸氯高組 10 55.76 ±7.08＊＊伸氯低組 10 66.14 ±5.14正常對照組＊＊

表1所示，模型組與正常對照組相比，AA大鼠血清RF含量明顯增高，差異具有顯著意義(P＜0.01);西藥組(MTX)與模型組相比，AA大鼠血清RF含量有所降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中藥伸氯高組和伸氯低組與模型組相比，AA大鼠血清RF含量均明顯降低，差異具有顯著性意義(P＜0.01)。

2.2 伸筋草氯仿提取物對 AA大鼠血清TNF－α、IL－1β和IL－6含量的影響

應(yīng)用放射性免疫法檢測TNF－α、IL－1β和IL－6含量，檢測結(jié)果見表2。

表2 各實驗組大鼠血清細(xì)胞因子的水平(n=10，±s)

表2 各實驗組大鼠血清細(xì)胞因子的水平(n=10，±s)

注:與正常組相比，△△P＜0.01;與模型組相比，＊＊P＜0.01，*P＜0.05，#P＞0.05。

分組 TNF－α(ng/mL)IL－1β(ng/mL) IL－6(pg/mL)正常對照組0.243 ±0.042 0.159 ±0.034 87.51 ±3.86模型組 0.340 ±0.035△△0.267 ±0.039△△ 136.63 ±7.85△△MTX 組 0.260 ±0.035＊＊0.184 ±0.042＊＊ 100.44 ±20.71＊＊伸氯高組 0.264 ±0.020＊＊0.187 ±0.041＊＊ 123.30 ±8.28*伸氯低組 0.280 ±0.054* 0.211 ±0.065* 130.55 ±22.17#

表2所示，模型組與正常組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β和IL－6含量均升高，差異具有顯著性意義(P＜0.01);西藥組(MTX)與模型組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6含量降低，差異具有顯著性意義(P＜0.01);中藥伸氯高組與模型組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6含量均有明顯降低，差異具有顯著性意義(P＜0.01或P＜0.05);伸氯低組與模型組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而IL－6含量無明顯改善(P＞0.05)。

3 討論

伸筋草常被臨床用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)酸痛和跌打損傷等疾病，具有消腫鎮(zhèn)痛、舒筋活絡(luò)等功效［10］?，F(xiàn)代研究表明，伸筋草主要含有石松堿、棒石松堿、石松靈堿等生物堿成分;伸筋草醇、石松醇、芒柄花醇等三萜化合物;還含有少量的蒽醌類成分和揮發(fā)油類［11］。

近年文獻(xiàn)多有報道，RA的發(fā)病不但與類風(fēng)濕因子有關(guān)，而且與機(jī)體細(xì)胞因子水平失調(diào)密切相關(guān)。TNF－α和IL－1β常同時分泌及升高，在RA關(guān)節(jié)滑膜病變中起到共同致炎作用;IL－6的升高則能促進(jìn)B細(xì)胞合成RF及產(chǎn)生免疫球蛋白［12－13］。

本項目的前期研究工作已經(jīng)證實，AA模型大鼠血清中RF、TNF－α、IL－1β和IL－6等細(xì)胞因子的含量明顯升高，且造成關(guān)節(jié)局部炎性細(xì)胞浸潤，大鼠機(jī)體處于免疫失調(diào)狀態(tài)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)病;伸筋草乙醇、正丁醇提取物均能有效降低上述指標(biāo)［5－7］，同時還應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察到伸筋草醇提物能夠有效控制AA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜的病理改變［14－15］。

結(jié)合項目的前期報導(dǎo)和上述實驗結(jié)果，伸筋草提取物，無論是乙醇提取物、正丁醇提取物還是氯仿提取物，對AA大鼠血清RF皆有明顯的抑制作用并且其作用優(yōu)于西藥組，作用效果依次為乙醇提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、MTX;對于TNF－α，三種提取物作用相近，均能明顯降低其含量;對于IL－1β，三種提取物均有明顯的抑制作用，其中乙醇提取物、氯仿提取物高劑量、正丁醇提取物高劑量優(yōu)于氯仿提取物低劑量和正丁醇提取物低劑量;對于IL－6，乙醇提取物與正丁醇提取物的抑制作用優(yōu)于氯仿提取物的作用。

上述結(jié)論說明，伸筋草不同提取物均能有效降低血清中細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β和IL－6的含量，更能明顯降低RF的水平，達(dá)到減少關(guān)節(jié)炎癥、預(yù)防和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的目的。伸筋草藥源豐富，價格低廉，且無明顯的毒副作用，具有臨床應(yīng)用價值，因此對其防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的其它免疫機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Walsmith J，Abad L，Snydman L，et al.Interleukin － 1b and tumour necrosis factor－α exhibit different metabolic effects in rheumatoid arthritis(RA)［J］.FASEB J，2000，14(4):525.

［2］李玉林，唐建武.病理學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:252.

［3］路秀英.免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子及其抑制物在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用［J］.國外醫(yī)學(xué)·免疫學(xué)分冊，1993，16(4):183.

［4］Lars Klareskoga，Hugh McDevittb.Rheumatoid arthritis and its animal models:the role of TNF－α and the possible absence of specific immune reactions［J］.Current Opinion in Immunology，1999，11(6):657－662.

［5］苗兵，楊金，周忠光，等.伸筋草乙醇提取物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠類風(fēng)濕因子和血清細(xì)胞因子的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2008，25(3):22－24.

［6］敖鵬，劉玉婕，尹麗穎，等.伸筋草正丁醇提取物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清 IL－1β、IL－6、TNF－α 的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(3):22－24.

［7］呂衡，周忠光，邊曉燕，等.伸筋草提取物對AA大鼠RF及Ig影響的實驗研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，24(3):274－276.

［8］Krishnaswamy Kannan，Robert A，Ortmann，et al.Animal models of rheumatoid arthritis and their relevance to human disease［J］.Pathophysiology，2005，12(3):167 －181.

［9］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.

［10］鄭虎占，董澤宏，佘靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用［M］.北京:學(xué)苑出版社，1997:72.

［11］滕翠翠，何永志，王穎，等.伸筋草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(20):3174 －3175.

［12］Shimon Sakaguchi，Noriko Sakaguchi.Animal models of arthritis caused by systemic alteration of the immune system［J］.Current Opinion in Immunology，2005，17(6):589 －594.

［13］Niki Y，Yamada H，Seki S，et al.Macrophage and neutrophil－ dominant arthritis in human IL － 1 alpha transgenic mice［J］.J Clin Invest，2001，107:1127 － 1135.

［14］尹麗穎，邊曉燕，韓玉生，等.伸筋草醇提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織的形態(tài)學(xué)影響［J］.中醫(yī)藥信息，2008，25(2):28 －30.

［15］張東軍，邊曉燕，尹麗穎，等.伸筋草乙醇提取物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用的實驗研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(4):41－42.