曹素芳，祁畫麗

（鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州450011）

白細(xì)胞介素18（interleukin－18，IL－18）是一種多功能細(xì)胞因子，既參與天然免疫應(yīng)答，又參與特異性免疫應(yīng)答［1］。不但能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ，增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用等功能，而且能夠誘導(dǎo)分泌GM－CSF［2］。許多研究表明，IL－18具有顯著的免疫佐劑作用，在增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病原微生物感染等［3］方面有著潛在的應(yīng)用前景。近年來，Yohsuke Ogawa等［4］利用豬紅斑丹毒絲菌表達(dá)了豬IL－18，Shao PanFeng等［5］利用真核表達(dá)系統(tǒng)對豬IL－18進(jìn)行了表達(dá)及生物活性研究，牛偉等［6］構(gòu)建了PRRSV ORF6與豬IL－18的共表達(dá)真核質(zhì)粒，并對豬IL－18的免疫作用進(jìn)行了研究，王振亞等［7］利用桿狀病毒／

昆蟲系統(tǒng)對豬IL－18進(jìn)行了表達(dá)。豬IL－18克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性的研究，為豬病的防控及免疫佐劑研究提供了有力的理論依據(jù)。

本研究應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)，對豬IL－18進(jìn)行高效表達(dá)，分析其生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究其功能及與其他細(xì)胞因子之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，有助于將其開發(fā)為新的分子免疫佐劑。

1 材料與方法

1．1 菌株與載體 大腸桿菌DH5α為筆者所在實驗室保存，pGEMT／pIL－18重組質(zhì)粒由筆者構(gòu)建保存，酵母菌株P(guān)ichiapastorisX－33、載體pPICZαA均由韓先干博士提供。

1．2 酶及試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，XbaⅠ，SacⅠ，DL－2 000DNA Marker，低分子量蛋白質(zhì)Marker，Agarose Gel DNA Extraction Kit，均購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶，購自Promega公司；酵母DNA抽提試劑盒PUREGENE DNA Iso－lafion Kit，購自深圳晶美生物工程公司；酵母氮堿YNB和抗生素Zeocin，購自Invitrogen公司；酵母培養(yǎng)基YPD、BMGY和BMMY等的配制參照Invitrogen公司 Easy Select Piehia Expr－ession Kit的方法進(jìn)行。

1．3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已獲得的豬IL－18全基因序列，在其成熟蛋白［豬前體在IL－1β轉(zhuǎn)換酶（ICE）的作用下，去除信號肽序列，才能變?yōu)橛谢钚缘牡鞍祝菥幋a基因兩端合成1對引物。上游引物5′－CCGGAATT CTACTTTGGTAAG CTTG－3′，下游引物為5′－TGCTCTAGACT AGTTCTTGTTTTGAA－3′；同時設(shè)計根據(jù)pPICZαA的通用引物序列合成1對檢測引物：5′AOX1：5′－GACTGGTT CCAATT GACA AG C－3′；3′AOX1：′－GCAA ATGGCATTCT GACA TCC－3′。兩對引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1．4 豬IL－18基因畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 以pGEMT／pIL－18為模板擴(kuò)增豬IL－18成熟蛋白基因，PCR產(chǎn)物用回收后，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，回收約474bp大小的DNA片段，將其插入到畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIZαA相應(yīng)位點中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZ／pIL－18，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，用25μg／mL的抗生素Zeocin篩選重組大腸桿菌，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，并送TaKaRa公司測序。

1．5 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與鑒定 取5～10μg重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ／IL－18，經(jīng)SacI酶切線性化后，回收，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X－33，在500μg／mL Zeocin YPDS平板上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30℃培養(yǎng)平板2～3d至出現(xiàn)乳白色的菌落。用試劑盒PURE－GEN DNA Isolation Kit抽提畢赤酵母染色體DNA，以抽提的DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定。

1．6 豬IL－18的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將鑒定為陽性的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃260r／min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)16h，按5%比例將菌液轉(zhuǎn)接于10mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至菌體D600nm達(dá)到2～6時，離心棄上清，更換10mL BMMY培養(yǎng)基，用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)5d，使其終濃度為0．5%，期間每24h取樣并同時加入甲醇，收集上清進(jìn)行SDS－PAGE，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析表達(dá)產(chǎn)物。

將表達(dá)酵母菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集表達(dá)上清，用丙酮沉淀法濃縮。將預(yù)處理的Sephadex G－200裝柱后，用0．01moL／L的PBS進(jìn)行平衡，加入1mL收集上清，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0．5 mL／min，收集不同時段的蛋白組分。

1．7 表達(dá)的豬IL－18（pIL－18）活性檢測 無菌采集健康豬抗凝血，沿管壁輕輕加入等體積的淋巴細(xì)胞分層液面上，2 000r／min離心15min，小心收集中間的白色細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入0．5mL的PBS，混勻，8 000r／min離心1min，去上清，再用PBS洗滌2次，最后將細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基DMED中，將細(xì)胞稀釋成密度為2×106／mL的細(xì)胞懸液。

取100μL單細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，設(shè)4組，每組設(shè)10個重復(fù)孔，同時設(shè)不含細(xì)胞的培養(yǎng)液空白對照。除空白對照組外，另4組分別加入100 μL純化pIL－18、未純化pIL－18、LPS及 ConA，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，用MTT法檢測。采用SPSS軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2．1 重組質(zhì)粒pPICZ／pIL－18的構(gòu)建與鑒定 重組質(zhì)粒pPICZ／pIL－18經(jīng)用目的基因引物PCR擴(kuò)增獲得了約474bp的目的片段（圖1）；用通用引物進(jìn)行PCR鑒定，得到1條約1．0kb的條帶（圖2）；重組質(zhì)粒分別用EcoRⅠ、XbaⅠ單酶切，均得到1條約4．1kb的條帶；用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，得到1條3．6kb和1條0．5kb的條帶，均與預(yù)期相符（圖3）。重組質(zhì)粒測序的結(jié)果也與已知序列相符（數(shù)據(jù)略）。

圖3 pPICZ／pIL－18酶切鑒定結(jié)果

2．2 重組三元豬IL－18基因酵母菌株的鑒定 將陽性酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ／pIL－18用SacⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)化酵母X－33感受態(tài)細(xì)胞，篩選整合了豬IL－18基因的酵母。提取酵母基因組DNA，以此DNA為模板，利用畢赤酵母載體pPICZαA通用引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得了2．2kb和約1．0kb兩條帶（見圖4），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖4 重組酵母菌株的PCR鑒定

2．3 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性重組酵母菌株用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，24h后就能檢測到目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，到72h表達(dá)量最高，約為22kDa。而空載體pPICZαA轉(zhuǎn)化的酵母菌株誘導(dǎo)上清和陰性酵母對照菌株誘導(dǎo)上清液中在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)目的蛋白條帶（如圖5），表達(dá)上清中其他雜蛋白很少。電泳凝膠的掃描分析顯示，目的蛋白約占酵母誘導(dǎo)表達(dá)上清液中總蛋白的38%左右。

2．4 目的蛋白質(zhì)pIL－18純化 利用Sephadex G－200對表達(dá)的菌液上清進(jìn)行分離純化，收集兩個蛋白峰的組分，濃縮后進(jìn)行SDS－PAGE分析，發(fā)現(xiàn)洗脫出的目的蛋白比較純，幾乎沒有雜蛋白（圖6）。

將純化的pIL－18進(jìn)行過濾除菌后，用蛋白測定儀定量。應(yīng)用MTT法測定重組pIL－18轉(zhuǎn)化豬外周血淋巴細(xì)胞的活性，用SPSS統(tǒng)計軟件分析結(jié)果表明，純化的重組蛋白pIL－18與絲裂原ConA均能顯著促進(jìn)豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖 （P＜0．05），二者間沒有顯著差異。未純化的重組蛋白pIL－18與LPS也均能促進(jìn)豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖 （P＜0．05），二者間沒有顯著差異，但與純化后的重組pIL－18和ConA促進(jìn)作用差異顯著（表2）。

表1 豬IL－18重組蛋白促進(jìn)豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

3 討論

干豬IL－18是一類重要的細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。除誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN－γ外，還與許多細(xì)胞因子相互作用，參與體內(nèi)復(fù)雜的免疫應(yīng)答，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用［8］。近年來研究表明，IL－18主要免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為顯著活化T細(xì)胞，促進(jìn)其產(chǎn)生IFN－γ、IL－2及 GM－CSF 等多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（TCL）及NK細(xì)胞殺傷活性，促進(jìn)NK細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF）、IL－1、胞間粘附分子（ICMA－1）等表達(dá)［9－10］，清除被病原感染的細(xì)胞，提高機(jī)體免疫功能。而豬IL－18前體蛋白無任何生物活性，在第35位天冬氨酸殘基處有一個潛在的剪切位點ICE（白細(xì)胞介素1β轉(zhuǎn)換剪切酶位點），剪切后變?yōu)榫哂猩锘钚缘呢iIL－18成熟蛋白［11］。

為了獲得高表達(dá)的陽性酵母菌株，在本試驗中，設(shè)計引物時我們將個別堿基置換成酵母系統(tǒng)偏愛的密碼子，但其編碼的氨基酸不變，以期獲得高分泌的酵母菌株。陽性表達(dá)質(zhì)粒pPICZ／pIL－18經(jīng)SacⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)甲醇（終濃度含0．5%體積）誘導(dǎo)72h后，SDS－PAGE電泳顯示，得到1條分子量約為22．0kDa的蛋白條帶，與豬IL－18大小一致。其表達(dá)的可溶性蛋白約占酵母表達(dá)上清液中總蛋白的38%。結(jié)果表明，改造后的豬IL－18成熟蛋白基因在畢赤酵母X－33中獲得了高效分泌表達(dá)，經(jīng)純化后得到pIL－18可溶性蛋白。由于本試驗所選用的酵母表達(dá)載體pPICZαA是一種分泌表達(dá)載體，它能夠使外源基因在畢赤酵母中表達(dá)后分泌到上清液中，并能使表達(dá)的外源蛋白pIL－18進(jìn)行正確的折疊和糖基化修飾，使其具有與天然活性蛋白基本相似的空間結(jié)構(gòu)，因此所獲得的重組pIL－18無需變性復(fù)性就具有較高的生物學(xué)活性。

豬IL－18能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。用MTT法檢測重組pIL－18對豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，pIL－18能夠促進(jìn)豬外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，純化后的重組pIL－18其活性接近ConA的刺激效果，優(yōu)于LPS的刺激效果。

目前，在養(yǎng)豬業(yè)中，許多免疫抑制病毒感染豬后導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制或疫苗的免疫失敗，給豬傳染病的防控帶來很大的難度，嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。應(yīng)用豬IL－18作為免疫佐劑以提高機(jī)體免疫應(yīng)答水平，充分發(fā)揮免疫細(xì)胞對病原微生物的清除功能，是解決免疫失敗的有效方法。pIL－18重組蛋白的制備和活性檢測，為研究其在臨床中的應(yīng)用提供物質(zhì)支持。

［1］ Qiaomei Dai，Yang Li，F(xiàn)engshan Zhang．Therapeutic effect of low－dose IL－18combined with IL－10on collagen－induced arthritis by down－regulation of inflamma－tory and Th1responses and induction of Th2responses［J］．Rheumatol Int，2009，29：615－622．

［2］ Hivert M F．Sun Q，Shrader P，etal．Circulating IL－18and the risk of type 2diabetes in women［J］．Diabetologia，2009，52：2101－2108．

［3］ 方禮祿，陳書明，武文君．雞白細(xì)胞介素18（IL－18）與臨床疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展［J］．青海畜牧獸醫(yī)雜，2011，41（5）：47－48．

［4］ Yohsuke Ogawa，Yu Minagawa，F(xiàn)ang Shi，etal．Immunostimulatory Effects of Recombinant Erysipelothrix rhusiopathiae Expressing Porcine Interleukin－18in Mice and Pigs［J］．Clinical and vaccine immunology，2012，19（9）：1393－1398．

［5］ Shao PanFeng，Cui Pei，Zheng LanLan，etal．Construction of eukaryotic expression plasmid of porcine IL－18gene and identification of bioactivity of its expressed protein［J］．Northwest A＆F University－Natural Science Edition，2009，37（12）：85－90．

［6］ 牛偉，王中華，王曉莉，等．PRRSV ORF6及IL－18基因重組真核質(zhì)粒試驗免疫研究［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31（12）：1691－1694．

［7］ 王振亞，王彥彬，陳紅英，等．豬IL－18在桿狀病毒／昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)［J］．生物工程學(xué)報，2011，27（1）：118－123．

［8］ Yun Huang，Min Xu，Jie Hong，etal．607C／A polymorphism in the promoter of IL－18gene is associated with 2hpost－loading plasma glucose level in Chinese［J］．Endocrine，2010，37：507－512．

［9］ Hee Jung Kim，Seok Bean Song，Jung Min Choi，etal．IL－18 Downregulates Collagen Production in HumanDermal Fibroblasts via the ERK Pathway［J］．Investigative Dermatology，2010，130：706－715．

［10］Carl F，F(xiàn)ortin，Thornin Ear，Patrick P．McDonald．Autocrine role of endogenous interleukin－18on inflammatory cytokine eneration by human neutrophils［J］．FASEB，2009，23（1）：194－203．

［11］Ghayur T，Banerjee S，Hugunin M，etal．Caspase－1processes IFN－γ－inducing factor and regulates LPS－induced IFN－γ production［J］．Nature，1999，386：619－623．